著者は、peptoid 合成における技術支援のため氏マイケル ・ コノリーと博士ロナルド Zuckermann (の分子鋳造、ローレンス ・ バークレー国立研究所) を感謝したいです。我々 は、全米科学財団 (チェ ・ 1301505) からの支援を認めます。パシフィック大学で化学質量分析施設ですべての質量分析実験を行った。

1. Peptoid の合成
注: 合成樹脂の樹脂を膨潤・保護グループを削除するアクティブにするから始まります。樹脂モノマー添加サイクルの繰り返しで上に peptoid チェーンの成長が続きます。樹脂と結合した最初の単量体は、C 末端残基です。Peptoid は N 末端から C 末端細長い。目的の peptoid シーケンスを達成すると、樹脂はオフ切断、peptoid 製品を精製します。
<ol><li>試薬の調製 注: 液体の試薬、マイクロ ピペットを使用して測定したで、固体試薬分析用天秤を用いています。<ol>
<li>ミックス 6.2 mL の n、N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) と n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) DIC/DMF 溶液の 0.8 M を準備する 43.8 mL。</li>
		<li>0.8 M BMA/DMF 溶液を調製する DMF の 50.0 mL に BMA の 5.56 g を溶解します。</li>
		<li>2 mL ピペリジン (Pip) の 20% DMF Pip/ソリューションを達成するために DMF の 8 mL を混ぜます。</li>
		<li>1.9 mL Npe の 1.0 を達成するために DMF の 13.1 mL に溶解 M Npe/DMF。</li>
		<li>13.7 mL 1.0 を達成するために DMF に Nme の 1.3 mL を溶かす M Nme/DMF。</li>
		<li>0.32 mL ナエの 1.0 を達成するために DMF の 2 mL に溶解 M ナエ/DMF。 注意: 合成に使用される化学物質のほとんどは、危険です。トリフルオロ酢酸 (TFA) や DIC、Pip、BMA は、皮膚、目、呼吸器に有害な。DMF、ジクロロ メタン (DCM) は、発がん性を疑われています。ヒューム フードすべての反応を実行して、適切な個人用保護具を使用する必要があります。合成で使用されるすべての化学物質の化学物質等安全データシート (MSDS) をご確認ください。</li>
	</ol></li>
	<li>樹脂活性化
	<ol>
<li>84 mg 場アミド樹脂 (樹脂、0.047 ミリ モル 0.56 ミリ モル/g の読み込み) を測定し、10 mL のポリプロピレンの固相反応容器に追加。プランジャーを容器に挿入します。</li>
		<li>反応容器に DMF の 2 mL を加えて圧力キャップと容器のキャップします。シェーカーに容器を置き、キャップを取り外し、反応容器のプランジャーを押すことによって廃棄物コンテナーに約 12 度と 385 振動/分 30 分排水ソリューションのための動きの角度で常温で容器を揺り動かしなさい。</li>
		<li>容器に 20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加えて、容器のキャップします。2 分、シェーカーの扇動し、ドレインの廃棄物コンテナーにソリューション。</li>
		<li>20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加える容器、キャップ、容器とキャップ 12 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄容器への解決策をドレインします。</li>
		<li>DMF、キャップ、容器の 1 つの mL を追加することによって樹脂を洗い、キャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレイン 1 分の容器を攪拌します。4 追加回 DMF と樹脂を洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>モノマーを添加し、N 末端のアセチル化 注: 各モノマー添加サイクルは、2 つの反作用のステップ、bromoacetylation、変位を伴います。<ol>
<li>Nme 樹脂フォーム最初のモノマー添加サイクルを実行します。</li>
		<li>Bromoacetylation 反応を実行します。0.8 M BMA/DMF 溶液の 1 mL のビーカーに 0.8 M DIC/DMF 溶液 1 mL を混ぜます。樹脂を含む反応容器に混合物を転送し、容器のキャップします。シェーカーに容器を置くとキャップ 20 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄物コンテナーにソリューションをドレインします。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加する、容器のキャップ、1 分攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水によって樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。もう一度、DCM の樹脂を洗浄し、DMF で 2 回洗ってください。</li>
		<li>置換反応を行います。1.0 M Nme/DMF 溶液の 1 mL を追加し、容器のキャップ、キャップ 60 分削除のため室温で容器を扇動、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインします。</li>
		<li>1 mL DMF を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。1 ml の DCM、1 分攪拌を描画し、排水ソリューションにより樹脂を洗浄します。DMF で 2 回洗浄後もう一度、DCM を洗います。</li>
		<li>1.3.2 に 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4を形成するための手順からモノマー添加サイクルを繰り返す-樹脂。置換反応 (1.3.4) の手順を繰り返し、peptoid 順序に従って特定アミン溶液を使用します。 注: peptoid チェーンが伸長する C 末端から N 末端に樹脂にバインドされている C 末端残基を持つ。</li>
		<li>Ac-Nae-(Npe-Nme)4を形成する N 末端アセチル化を実行-樹脂。</li>
		<li>ミックス 92年 μ L の酢酸無水、43.5 μ N、N diisopropylethylamine (DIPEA)、ビーカーに DMF の 2 mL、約 2 mL のアセチル化をカクテルを作る。</li>
		<li>樹脂を含む容器に 2 mL のアセチル化のカクテルを追加、キャップ、容器および 60 分のキャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインの室温でそれを扇動します。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。DCM、一度より多くの樹脂、さらに 2 回 DMF で洗浄洗浄を繰り返します。</li>
		<li>DCM の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM で 2 回洗浄を繰り返します。キャップをはずし、10 分間反応容器内空気乾燥させる樹脂。</li>
	</ol></li>
	<li>胸の谷間と浄化
	<ol>
<li>TFA、triisopropylsilane (ヒント) を 100 μ l 添加 HPLC グレード H2O ビーカーに 100 μ L の胸の谷間の 4 mL のカクテルを作るための 3.8 mL を混ぜます。</li>
		<li>4 mL の新鮮な作った胸の谷間カクテル樹脂を含む容器に追加、容器、キャップ、2 時間室温で攪拌します。</li>
		<li>キャップをはずし、50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液ソリューションを収集します。容器に TFA の 1 mL を追加、キャップ、および 1 分同じ遠心管に収集濾液ソリューションを扇動します。</li>
		<li>粘性解は左が約 1 mL まで窒素ガスのストリームで優しく吹いて TFA を蒸発させます。</li>
		<li>残りの溶液にジエチル エーテル 15 mL を追加、遠心分離機管のキャップ、一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーでそれを孵化させなさい。原油の peptoid は、白色固体として析出します。</li>
		<li>遠心分離機管のキャップ 10 分削除 4,427 × g で遠心分離機を用いた固体のペレットし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカントします。 注意: ジエチル エーテルは可燃性の有機溶剤です。ジエチル エーテルの安全なの遠心分離機を使用してください。</li>
		<li>洗浄は遠心分離機に冷たいジエチル エーテル 10 mL を加えることによって固体管、固体を含むチューブをキャップと遠心分離機で配置すること。10 分間遠心遠心分離機からチューブし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカント削除 4,427 × g で遠心分離を行います。</li>
		<li>固体を乾燥するには、窒素ガスのストリームでやさしく吹いて。</li>
		<li>HPLC グレード H2O 乾燥した固体を溶解するための 10 mL を追加します。ソリューションを孔径 0.45 μ m のナイロン シリンジ フィルターを通過し、前加重 50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液を収集します。</li>
		<li>シェル固定ソリューションを配置し、液体窒素で満たされた 12 オンス、ダブル スタック拡張ポリスチレン カップに 1/3 peptoid ソリューションを含む遠心管を回転します。固体 peptoid を生成するため冷凍ソリューション一晩を凍結乾燥します。</li>
		<li>HPLC グレード H2O の mL の 10 に固体 peptoid を溶解して凍結 1 つより多くの時間を繰り返し、液体窒素で凍結し、一晩を lyophilizing をシェルします。結果として得られる peptoid は、質量分析法による配列解析のために十分に純粋です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS 測定と解析
注: MS/MS 実験はエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) ソースに結合トリプル四重極質量分析計で実施です。データ コレクションは、楽器を伴うデータ集録ソフトウェアを使用して制御されます。一般的な手順が含まれています 1) フル スキャン質量分析実験を行うと実験 2) MS/MS シドを実行する質量スペクトルを記録、MS/MS スペクトルを記録し、3) 理論 MS/MS スペクトル データを比較します。フラグメント化スキームは、peptoid の構造的特徴に基づく予測します。
<ol><li>試料溶液の調製
	<ol>
<li>3-5 mL のガラス瓶で 1.0 2.0 mg 固体 peptoid を重量を量る。溶解、peptoid に 1 mL 混合溶剤のアセトニ トリルと水 (ACN/H2O、1:1、v/v) を追加します。これは約 10-3 M の濃度でストック サンプル ソリューションを提供します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに 20 μ L の原液を転送し、ACN/H2O 約 10-5 M の希釈試料溶液を生成するための 1 mL 混合溶媒を追加します。</li>
		<li>3 分別 1.5 mL 遠心にソリューションのトップの部分の約 700 μ L を転送の 4,427 × g で遠心分離を実行することによって希釈試料溶液の任意の可能な不溶性粒子 peptoid MS の実用的なソリューションを作るにチューブを削除約 10-5 M の濃度。</li>
		<li>質量分析法による測定では, 観測信号強度に基づく MS 作業溶液の濃度を調整します。</li>
		<li>0.20 μ m シリンジ フィルターを試料溶液を通過し、濾液を収集 peptoid MS 約 10-5 の実用的なソリューションを作るに 1.5 mL 遠心チューブには希釈試料溶液の任意の可能な不溶性の粒子を除去する方法M。</li>
	</ol></li>
	<li>質量スペクトルを記録
	<ol>
<li>エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 源によって ACN/H2O (1:1、v/v) の混合溶媒を実行し、標準的な肯定的なイオンの計測器、質量電荷比 (m/z) 100-1500 の範囲と完全なスキャン質量分析モードを設定します。 メモ: 典型的な動作パラメーター: ESI 針電圧 5 kV キャピラリー電圧 40 V 乾燥ガス (窒素ガス) の温度は、200 ° C</li>
		<li>500 μ L または 1 mL の注射器に peptoid MS 作業ソリューション (約 10-5 M) の約 300 μ L を追加し、キャピラリー ポリエーテル エーテル ケトン (ピーク) チューブを用いた ESI 入口に注射器を接続します。シリンジ ポンプに注射器を置き、ESI 入口に試料溶液を注入する 10 μ L/分の流量を設定します。</li>
		<li>ESI プロセスをアクティブに ESI 針電圧をオンにし、検出器の電源を入れます。プロフィール モードで 100-1,500 の m/z 範囲表示を設定します。プロファイル ウィンドウに示すように質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 (m/z 1,264.6 のとして表示) でピークは peptoid イオンまたはプロトン化 peptoid に対応します。</li>
		<li>2 分の MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。 注: 結果の質量スペクトルは図 3に示すです。</li>
		<li>M/z 1,265 のピークの強度を最適化します。1,150 1,350 m/z 範囲を設定し、プロフィール ウィンドウに表示される mV でピーク強度を表示しながら毛細血管の電圧を調整します。たとえば、増加するキャピラリー電圧 50 V をまたはより高いピーク強度の変化を見ると。最適なピーク強度は 150-200 mV。 注: キャピラリー電圧を調整すると、特定イオンの豊かさが大きく変わる。キャピラリー電圧を増加 peptoid イオンの強度を高めることができます。しかし、高キャピラリー電圧がイオン源の peptoid イオンの解離を引き起こすも、観測強度を減少します。M/z 1,265, ピークの強度を高めることができるガスを乾燥の温度を調整するキャピラリー電圧を調整するよりも効果的です。M/z 1,265 でピークが最適な強度が到達しない場合は、サンプルの濃度 (または二重 MS 作業溶液の濃度など) を調整します。</li>
		<li>楽器を MS/MS モードに切り替えます。M/z 1,265 前駆イオンを設定し、MS/質量質量 100 1,400 の m/z の範囲。「メソッド ウィンドウ」で「第 1 四半期最初のミサ」として m/z 1,265 を使用し、、「第 1 四半期最後のミサ」を空白のままにします。「Q3 最後質量」として「第 3 四半期最初のミサ」、m/z 1,400 m/z 100 を使用 注: MS/MS モード、前駆イオンと peptoid イオンを分離する質量フィルターとして最初の四重極ユニット (Q1) 機能で第 2 四重極ユニット (Q2) は衝突セルと 3 つ目の四重極ユニット (Q3) 機能質量分析器として。</li>
		<li>1.5 mtorr 圧 40 eV で衝突エネルギーと衝突ガス (アルゴン、この場合) セットします。</li>
		<li>プロファイル ウィンドウに表示質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 のピークは peptoid イオンに対応し、m/z 値の低いピークは peptoid イオンからフラグメントを表します。</li>
		<li>断片化スペクトルの表示を最適化するために衝突エネルギーを調整します。45 eV に衝突エネルギーを増やすなど、スペクトルの変化を表示します。 注: 一般的に、衝突エネルギーを増加強化フラグメント イオンの豊富なし peptoid イオンの豊かさを減らします。衝突ガス圧力を増加させると、フラグメント イオンの豊かさをまた高めます。 注意: 2 mTorr を超えて衝突ガス圧を増やさないでください。</li>
		<li>2 分の MS/MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。</li>
		<li>1-2 回の記録を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid シーケンス解析 注: CID の条件の下で一連の B イオンと呼ばれる N 末端フラグメントと Y イオンと呼ばれる C 末端フラグメントのシリーズを生成する peptoid バックボーンに沿ってアミド結合でフラグメントは peptoid イオン<ol>
<li>左側と右側に、C 末端に N 末端を置くことによってアセチル化 peptoid の化学構造を描画し、フラグメント化スキームを図 2 aに示すように、生成する各アミド結合で破線を描画します。電荷キャリアを示す破線の円内でプロトンを描画します。構造体の左側から開始して、B1B2B8として N 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。右側から始まって、Y1Y2Y8として C 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。 注: 化学ソフトウェアの描画は、peptoid 構造を描画する使用できます。</li>
		<li>左から 4番目のアミド結合での断片化を想像して、N 末端フラグメントと図 2 bに示すように、適切な正式な料金と C 末端フラグメントの構造を描きます。N 末端フラグメントで B4のラベルを配置し、C 末端フラグメントの Y5のラベルを配置します。580 の値を生成するための構造の要素の公称質量を合計することによって B4の m/z 値を計算し、N 末端フラグメントで 580 m/z を配置します。Y5 m/z 値を計算し、C 末端フラグメントの 685 m/z を配置します。</li>
		<li>すべて 8 B イオンおよびすべての 8 Y イオンの m/z 値を計算し、表 1に示すように、テーブルでは、それらを組み立てます。 注: フラグメントの m/z 値は描画ソフトウェア化学を使用して計算できます。</li>
		<li>楽器を伴うデータ レビュー ソフトウェアを使用して peptoid の記録の MS/MS スペクトルを開きます。「イオンのラベルを表示する」にラベル設定とラベルしきい値を 3% に設定します。これはピークのラベルの付いた m/z 値の MS/MS スペクトルを生成します。</li>
		<li>MS/MS スペクトル データを csv ファイル形式のテキスト ファイルとして書式設定し、データ処理ソフトウェアを使用してスペクトルを再構築をエクスポートします。ピークの m/z 値を配置します。結果の MS/MS スペクトルを図 4に示します。 メモ: いくつかの質量分析計は、MS/MS スペクトルを生成するデータ処理ソフトウェアが装備されています。この場合、MS/MS スペクトル データをエクスポートする必要はありません。</li>
		<li>表示、対応する B と Y-イオンを識別するために表 1に示されるように MS/MS スペクトル m/z 値を割り当てます。B4m/z 580 でピークを識別するたとえば、-イオンと 685 m/z が Y5として識別されて-イオン。図 4に示すように、スペクトルに対応する B と Y 記号のピークのラベルを付けます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

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提示プロトコルを使用して nonamer peptoid、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2は合成されています。合成装置には、注射器のようなポリプロピレン固相反応容器と機械的シェーカーが含まれます。反応容器は商業的に低コストです。機械的シェーカーは、化学実験室で一般的な装置です。注射器のような反応容器を使って、ソリューションは引き込まれるしプランジャーを手動で移動することに?...

ペプチドは、ペプチドの構造を模したバックボーン構造を持つシーケンス制御された高分子のクラスです。ペプチド合成できる多様なアミンから高度可変プロパティ1,2を展示するペプチドを可能にします。ペプチドは、生物物理学的研究、治療薬として考えられている、タンパク質3,4,5,6配位子として設計されて分子モデルとして使用されています。ペプチドは、防汚と抗体ミメティック材料、抗菌薬、酵素阻害剤7,8,9などの生理活性物質の多様性に開発されています。高い順序と可変自然とペプチドも考えられたの分子情報ストレージ10の種類として。シーケンスとペプチドの構造を特徴付けるため効率的な分析法の開発のためのこれらの多様なアプリケーション呼び出しの発見。タンデム質量分析を用いた手法は、ペプチド11,12,13を含む、シーケンス制御された高分子のシーケンスのプロパティを分析するための選択の方法として約束を示しています。 14,15。しかし、体系的な研究から生じる peptoid イオン断片化パターンを関連付ける質量分析研究、ペプチドの構造情報が非常に限られました。
ペプチドは、固相メソッドを使用して容易に合成することができます。よく発達したメソッドには、2 段階モノマー添加サイクル16,17のイテレーションが含まれます。またサイクルごとに樹脂連結アミンはハロ酸 (通常ブロモ酢酸、BMA)、によってアセチル化し、第一次アミンの置換反応が続きます。標準化学研究所16,18,19、で優秀な利回りとペプチドを手動で合成できる自動合成プロトコルは、peptoid 合成の日常的に適用されているが20。
当研究室は、手動 peptoid 合成法を採用したあり、既存のメソッドで使用される装置を簡略化します。ペプチド ・ MS/MS テクニック21,22,23を使用して一連の分裂パターンは学んだこともあります。衝突誘起解離 (CID)21,23にさらされるまたは電子捕獲解離 (ECD)22実験時、ペプチドが特徴的な分裂を生成することが分かった。この記事では、標準的な化学実験室でのオリゴ ペプチドの合成方法、トリプル四重極の質量分析計を用いた CID 実験を実行する方法およびスペクトル データを分析する方法を示しています。合成して特徴付けられる peptoid は、N 末端アセチル化、C 末端アミド化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と nonamer です。Peptoid の構造を図 1に示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td>
			<td>Agilent Technologies Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td>
			<td>Varian Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The software is a part of the Varian 320L package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td>
			<td>Fisher Scientific International Inc.</td>
			<td>14-400-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td>
			<td>Hermle Labortechnik GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>SF-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure caps for reaction vessels</td>
			<td>Torviq</td>
			<td>PC-SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, pore size 0.45 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>03-391-3A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>490001-620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td>
			<td>CambridgeSoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam cup, 12 Oz</td>
			<td>Common Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink amide resin</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>10619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>02351</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N&#8217;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00110</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>26843</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenylethylamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>EM8.07334.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyoxyethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>241067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Boc-ethylenediamine</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>AAAL19947-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic anhydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>252845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-dimethylformamide</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1117-4LG</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N, N-diisopropylethylamine</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>01966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00289</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>ZMQP60001</td>
			<td>For generating HPLC grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced from Millipore MILLI-Q&#174; Academic Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>339USP/NF</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific International, Inc.</td>
			<td>A998-4</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1121-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>BDH1113-19L</td>
			<td>Further distillation before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>NIT 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td>
			<td>ARG 50-C-F</td>
			<td>Ultra high purity, 99.9995%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

ペプチドは、N-アルキル グリシン ユニットで構成されるシーケンス制御ペプチド模倣オリゴマーです。多くの潜在的なアプリケーション間で、ペプチドは、分子情報ストレージの種類としての考えられてきました。質量分析は、配列ペプチドの選択の方法を考えられています。ペプチドは、繰り返し 2 段階反応サイクルを用いた固相化学経由で合成できます。タンデム質量分析 (MS/MS) 技術を用いたペプチドの順序を分析する手動でオリゴ ペプチドを合成する方法をご紹介します。サンプル peptoid は、n-(2-アミノエチル) グリシン (ナエ) N 末端と同様に n-(2-methyloxyethyl) グリシン (Nme) と n-(2-フェニルエチル) グリシン (Npe) を交互に構成される nonamer です。Peptoid のシーケンス式は Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2Ac がアセチル基であります。合成は、市販の固相反応容器で行われます。スケート リンクのアミド樹脂は C 末端にアミド基をもつ peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。結果の peptoid 製品は、エレクトロ スプレー イオン化ソースに結合トリプル四重極質量分析計を用いたシーケンス解析を受けます。MS/MS 測定は、充電 peptoid の解離から生じるフラグメント イオンのスペクトルを生成します。フラグメント イオン質量電荷比 (m/z) の値を基に並べ替えられます。フラグメント イオンの m/z 値は peptoid 断片化のスキームに従って理論的に予測されたフラグメント イオンの名目の固まりと比較されます。分析は、充電 peptoid のフラグメント パターンを生成します。断片化パターン中立的な peptoid のモノマー シーケンスに相関しています。この点で、質量分析は、ペプチドのシーケンス情報を読み出します。

N 末端アセチル化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と 9 mer の peptoid の構造を図 1に示します。Peptoid は、固相によるガラスフリットのポリプロピレン製反応容器に手動で合成されました。スケート リンク アミド樹脂 (0.047 ミリ モル、0.56 ミリ モル/g の読み込みに 84 mg) は、化の C 末端と peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。Pept...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K ビュー.  University of the Pacific. プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

化学

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds by mass spectrometry is not easily achieved, as all state-of-the-art mass spectrometric methods require at least one sample preparation step, e.g., dissolution and dilution of the analyte (electrospray ionization), co-crystallization of the analyte with a matrix compound (matrix-assisted laser desorption/ionization), or transfer of the prepared samples into the ionization source of the mass spectrometer, to be conducted under atmospheric conditions. Here, the use of a sample inlet system is described which enables the analysis of volatile metal organyls, silanes, and phosphanes using a sector field mass spectrometer equipped with an electron impact ionization source. All sample preparation steps and the sample introduction into the ion source of the mass spectrometer take place either under air-free conditions or under vacuum, enabling the analysis of compounds highly susceptible to oxidation. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes, which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique. The principle of operation is presented in this video.

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The presented technique is especially of interest for inorganic chemists, working with metal organyls, silanes, or phosphanes which have to be handled using inert conditions, such as the Schlenk technique.

コー​​ルドインレットシステムおよび電子衝撃質量分析法を用いて揮発し、酸化に敏感な化合物の分析

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

単一懸濁細胞における薬物および代謝産物の質量分析分析のための単一プローブと結合された統合細胞操作プラットフォーム

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

合成とオリゴペプチドの質量分析