L.K. es el recipiente de la concesión de beca posgrado beca de 4 años (4YF) Universidad de British Columbia. L.M.S. es el destinatario de una Asociación canadiense de Gastroenterología / de Crohn y de Colitis de Canadá / Premio CIHR nuevo salario del investigador y es un erudito Biomédica de la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud. Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de Canadian Blood Services, en colaboración con los institutos de salud de investigación de Canadá (concesión # CIHR2016-LS).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de British Columbia.
1. médula ósea macrófagos derivación y activación con anticuerpos
<ol>
	<li>Realizar la eutanasia usando CO2 asfixia.<ol>
		<li>Ratón de lugar en cámara de inducción. Eutanasia a ratón con anestesia isoflurano de 5%, para 60-90 s, hasta que inmóviles y la respiración profunda y lenta.</li>
		<li>Apague la anestesia isoflurano y administrar 6-8 L/min de CO2 hasta que el ratón ha dejado de respirar. Dejar ratón con CO2 al menos otros 5 minutos Verifique que ya no es un latido cardíaco o respiración. Realizar una dislocación cervical para asegurar la muerte. Nota: 8-12 semanas viejos ratones proporcionan el mayor rendimiento de los macrófagos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray patas de ratón con etanol al 70% y el pin con brazos y piernas estiradas en la posición supina sobre un tablero de la espuma. Con tijeras y pinzas para sujetar la piel, hacer un corte poco profundo (0,2 cm) para quitar la piel y el pelaje de la superficie de cada una de las patas traseras. Nota: Realice este procedimiento y todas las manipulaciones de cultivo de tejidos en una campana estéril.</li>
	<li>Recorte muscular para visibilizar tibias y fémures. Quite la tibia y el fémur, cortando el hueso y los músculos debajo de la articulación de la cadera y por encima de los tobillos. Recorte tanto músculo como sea posible.</li>
	<li>Pulverizar los huesos con etanol al 70% y espere 1 minuto para que se evapore, luego colocarlos en placa 6 bien de medio al ras del hueso (Iscove modificado medio de Dulbecco (IMDM), 10% suero bovino fetal (FBS)).</li>
	<li>Recorte los extremos de los huesos mediante la reducción de 0,1 cm de hueso del tobillo y parte superior del fémur por lo que se expone la cavidad ósea. Asegúrese de que la médula es visible y se puede colocar una aguja de 26 calibre en la cavidad del hueso.</li>
	<li>Cortar los huesos y músculos para separar la tibias y fémures de los empalmes de rodilla. Inserte una aguja 26 calibre unida a una jeringa de 10 mL en la cavidad. Enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 50 mL con 5 mL de medio al ras del hueso. Ras dos tibias y dos fémures, desde un ratón, en cada tubo de 50 mL.</li>
	<li>Pipetear arriba y abajo varias veces o vórtice la médula a una velocidad lenta para dispersar a grupos suavemente. Cadenas de médula deben dividirse en manchas pequeñas (menos de 0,5 mm) de médula ósea. Llene el tubo cónico de 50 mL con medio al ras del hueso. Contenido de la pipeta del tubo cónico en un cultivo de tejidos2 75 cm tratado frasco e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 1 h. Nota: Los macrófagos maduros y las células mesenquimales se convertirá en adherentes al matraz y descartarse, mientras que los progenitores hematopoyéticos deseados permanecerán en suspensión.</li>
	<li>Pipetear el soporte con progenitores hematopoyéticos en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo factor (MCSF) el estimular de Colonia de macrófagos (IMDM, 10% FBS, MCSF de 5 ng/mL, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina y 150 μM Monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro18. Añadir medio para resuspender las células a una concentración de 0,5 x 106 células/mL, 1,5 x 107 células/frasco de 30 mL de medio y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo. Pipeta de 30 mL de la suspensión a un matraz de cultivo de tejidos tratado nueva de 75 cm2 .</li>
	<li>El día 4 y día 7 después de la primera cultura en el paso 1.9, comprobar que las células son adherentes y ligeramente ramificado usando un microscopio de campo brillante de contraste de fase invertida. Descartar el medio que contiene las células no adherentes. Lavar las células con IMDM una vez y añadir 30 mL de medio de cultivo MCSF.</li>
	<li>Cuando las células son maduras por día 10 (&#62; 95% positivo para F4/80 y Mac-1), compruebe otra vez que las células son adherentes y ligeramente.</li>
	<li>Células por estímulos de la placa, retirar el medio de cultivo del frasco y añadir 8 mL de buffer de enzima libre, basada en EDTA células disociación (Tabla de materiales). Incube las células durante 5 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Raspar las células suavemente, con una pequeña cantidad de presión, usando un raspador celular estéril. Comprobar en el microscopio que las células han separado de la superficie del frasco. Pipetear las células disociadas en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el matraz 3 veces con 5 mL de IMDM y la solución de enjuague con las células que se cosecharon de la piscina. Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 3 mL de medio de cultivo MCSF por el tubo cónico de 50 mL. Contar las células viables usando un hemocitómetro18. Resuspender las células a una concentración de 1 x 106 células/mL y la placa de 100 μL de suspensión celular (1 x 105 células/pocillo) por pozo de una cultura de tejido de 96 pocillos tratada, placa de fondo plano. Nota: Los huesos de un ratón va a generar suficientes células para pozos de 100. Si lo desea, 1 mL de células puede ser plateado en una placa de 6 pozos (cultivo de tejidos tratados, plano abajo). Un mayor número de células (1 x 106 células) puede ser útil para los análisis de western blot.</li>
	<li>Una vez adheridas, estimular el duplicado o triplicado pozos cada uno con 10 ng/mL de LPS en IMDM, 30 mg/mL de inmunoglobulina intravenosa, o IgIV + LPS. Dosis de LPS o IgIV pueden titularse para optimizar las respuestas. Deje duplicados o triplicados pozos controles sin estimular. Incúbelos durante 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Las células re-plateadas deben adherirse a pocillos de cultivo de tejidos en 1 h.</li>
	<li>Recoger sobrenadante de células de cada pozo en tubos de microcentrífuga de 1,7 mL individual y quitar cualquier materia particulada por giro a 10.000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Retire el sobrenadante de la célula y evitar perturbar el sedimento. Lugar la célula clarificada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga estéril. Nota: Sobrenadantes celulares pueden ensayarse para citoquinas IL-10 y subunidad de la citoquina IL-12 / 23p 40, por el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) inmediatamente, o almacenados a-80 ° C a largo plazo. Seguir protocolo de ELISA kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Otras citoquinas proinflamatorias pueden ensayarse, tales como IL-6 y TNF, como también son reducidas por co tratamiento con IgIV + estimulación LPS en comparación con la estimulación con LPS solo. Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como western blot o polimerasa cuantitativa (Q-PCR) reacción en cadena 19,20.</li>
</ol>
2. un reto ratones In Vivo con la IgIV y la cosecha de los macrófagos peritoneales
<ol>
	<li>Peso de cada ratón.</li></ol>Calcular el volumen de la IgIV (concentración stock de 100 mg/mL) necesaria para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal para cada ratón. Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de inmunoglobulina intravenosa se requiere.
	<li>Sorteo la cantidad necesaria de IVIg en una jeringa estéril de 1 mL provista de un estéril 26 Medidor de aguja. Para los ratones de control que no va a recibir IgIV, administrar un volumen de dosis equivalente de tampón de fosfato estéril salino (PBS), pH 7,4, en vez de IgIV.</li>
	<li>Pescuezo del ratón con una mano agarrando la piel en la nuca con el pulgar y el dedo índice y sostiene su cola y patas traseras con los dedos restantes. Incline su cuerpo hacia el suelo.</li>
	<li>Coloque la aguja formando un ángulo de 30-40° en relación con el abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, bisel hacia arriba e inserte 1,5 cm de la aguja. Inyectar por vía intraperitoneal la IVIg o PBS. Esperar 1 h.</li>
	<li>Eutanasia a ratones con 5% isoflurano anestesia seguida de 6-8 L/min CO2 asfixia (ver pasos 1.1.1 - 1.1.2), o de acuerdo con los principios éticos de la institución.</li>
	<li>Pin el ratón a un tablero de la espuma, con los miembros dispersos. Rocíe las piezas con etanol al 70%. Nota: Realice el procedimiento en una campana estéril.</li>
	<li>Hacer un corte superficial en la piel (0,2 cm) con tijeras a lo largo de la línea media del ratón, para evitar el corte de la cavidad peritoneal. Tire de la piel abdominal fuera del vientre del ratón con unas pinzas, para que el revestimiento de la pared peritoneal intacta es visible.</li>
	<li>Llene una jeringa de 5 mL con 5 mL de PBS estéril (pH 7.4). Inserte un 25 o 27 medidor de aguja en la parte superior de la cavidad de la izquierda o derecha hacia el centro del ratón con el bisel de la aguja hacia arriba. Nota: Coloque la aguja cuidadosamente en el ratón para que no inyecte PBS en los órganos, sino más bien, en el espacio peritoneal.</li>
	<li>Introduzca el líquido en la cavidad peritoneal. Saque la aguja de la cavidad y masaje del peritoneo para 10 s para desalojar a las células. Inserte la aguja en la parte superior de la cavidad y evitar órganos. Recoger y colocar el líquido de lavado se recuperó en un tubo cónico de 15 mL en hielo. Nota: Por cada 5 mL de líquido inyectado, aproximadamente 3,75 mL serán recuperado.</li>
	<li>Repetir la inyección y recuperación (pasos 2.8-2.9) 3 más veces (volumen total de inyección de 20 mL), recuperar 15 mL del líquido de lavado en total. Recoger el lavado de cada ratón en un tubo cónico de 15 mL separadas. Nota: Después de la inyección final, puede ser más fácil extraer el líquido de los lados lejos izquierdos y derecho del ratón, donde se ha acumulado líquido. Los órganos causan menos interferencia con la aguja en esta posición.</li>
	<li>Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 500 μL de medio de galjanoplastia (IMDM, 10% FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) por lavado del ratón. Recuento viables macrófagos utilizando un hemocitómetro18. Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales. Rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje. Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis para eliminarlos, utilizando el tampón de lisis de glóbulos rojos 1 x según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Resuspender las células en placas medio macrófagos 1 x 10 6/ml y 100 μL por pozo en una placa de cultivo de tejidos Tratado de fondo plano de 96 pozos de la placa. Nota: Puede ser necesario piscina células de más de un ratón para un experimento si utiliza triplicadas pozos o valoración de estimulantes. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario. Habría suficientes células para 5 pozos o 1 experimento por duplicado, con una dosis de LPS.</li>
	<li>Incubar 1 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que los macrófagos a convertirse en células adherentes. Las células adherentes son los macrófagos peritoneales. Retire el sobrenadante de células y las células no adherentes. Enjuagar los pozos dos veces con 200 μL IMDM (previamente calentado a 37 ° C), esperar 10 s y lentamente incline la placa. Reemplazar el medio de la galjanoplastia. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2 por 30 min antes de la estimulación.</li>
	<li>Estimular los macrófagos con 10 ng/mL de LPS en IMDM, o dejar sin estimular, como un control. Incubar durante 24 h, recoger y clarificar sobrenadantes de células (ver pasos 1.16 1.17) para IL-10 citoquina análisis mediante ELISA. Seguir protocolo de ELISA kit disponible comercialmente (Tabla de materiales). Nota: Después de la estimulación, las células adherentes se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR.</li>

3. un reto ratones in Vivo con IgIV + LPS y cosecha de los macrófagos peritoneales
<ol>
	<li>Peso de cada ratón. Calcular el volumen de la IgIV (concentración stock de 100 mg/mL) necesaria para proporcionar una dosis final de 2,5 g/kg de peso corporal. Calcular la cantidad de LPS (concentración stock de 100 μg/mL de IMDM) necesaria para proporcionar una dosis final de 0.2 μg/g de peso corporal. Nota: por ejemplo, para un ratón de 20 g, 500 μl de solución stock de IVIg y 40 μL de una solución 100 μg/mL de LPS se requiere.</li>
	<li>Extraer la cantidad necesaria de IVIg y LPS en una jeringa estéril de 1 mL con una estéril 26 Medidor de aguja. Para los ratones de control que no va a recibir IgIV, reemplazar un volumen equivalente de la IgIV con pH de PBS estéril 7.4.</li>
	<li>Pescuezo del ratón con una mano agarrando la piel en la nuca con el pulgar y el dedo índice y sostiene su cola y patas traseras con los dedos restantes. Incline su cuerpo hacia el suelo.</li>
	<li>Coloque la aguja en un ángulo de 30-40° en relación con el abdomen del ratón, en el cuadrante inferior derecho, bisel e introduzca 1,5 cm. inyectar la IVIg LPS, o PBS + LPS, por vía intraperitoneal como en el paso 2.4.</li>
	<li>Después de 1h, cosecha de macrófagos peritoneales mediante pasos 2.5-2.10.</li>
	<li>Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Retirar 1 mL del líquido de lavado recuperado y utilice para IL-10 y IL-12 / 23p 40 análisis por ELISA según instrucciones del fabricante o congelar a-80 ° C para los análisis futuros. Nota: Para asegurar la comparación precisa entre los tratamientos para el análisis de citoquinas líquido de lavado, realice flushs 5 mL de la cavidad peritoneal 4 veces para un volumen final de 15 mL. No todo el líquido será recuperado de cada descarga.</li>
	<li>Como en el paso 2.11, suspender y contar los macrófagos viables. Nota: Los macrófagos será ligeramente más grandes que las otras células peritoneales.</li></ol>Rendimiento típico es de 5 x 105 - 1 x 106 macrófagos/ratón utilizando un ratón C57BL/6 de tipo salvaje. Opcional: Si hay un gran número de glóbulos rojos en el sedimento celulares, realizar un paso de lisis siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminarlos, como en el paso 2.11.
	<li>Como en el paso 2.12, Resuspenda las células en medio de la galjanoplastia. Nota: Puede ser necesario a las células de la piscina de más de un ratón para un experimento. Por ejemplo, si un ratón tiene 5 x 105 macrófagos, 500 μL de medio de galjanoplastia sería necesario.</li>
	<li>Como en 2.13, incubar 1 h a 37 ° C 5% CO2 para permitir que los macrófagos a convertirse en células adherentes.</li>
	<li>Recoger y clarificar el medio condicionado, según medidas 1.14-1.15, de todas las células peritoneales. Nota: Las muestras se pueden usar inmediatamente o congeladas y almacenadas a-80 ° C para el análisis del cytokine por ELISA.</li>
	<li>Realizar paso 2.11, sino incubar las células durante 24 h sin estimular. Recoger y clarificar sobrenadantes de células, según pasos 1.16 1.17, para el análisis del cytokine por ELISA. Nota: Las células se pueden preparar para técnicas como el western blot o PCR, como en pasos 1.16 1.17 y 2.14.</li>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Estados de activación del macrófago juegan un papel importante en tanto tejido homeostasis y enfermedad22. Los macrófagos pueden tener distintas así como superposición de Estados de activación, dependiendo de señales en su microentorno3. Ellos tienen diferentes roles en todas las etapas de la respuesta inflamatoria: defensa contra agentes patógenos, restitución del tejido y cicatrización de la herida, y también tienen un estado de activación antiinflamatorio dis...

Los macrófagos son las células inmunes innatas, que desempeñan múltiples roles en la respuesta inmune a infección o lesión. Los macrófagos son responsables de iniciar una respuesta inmunitaria a la infección o tejido, deteniendo la respuesta inflamatoria y promover la curación de respuesta1. Ejemplos de los tres Estados de activación del macrófago mejor estudiados son: 1) los macrófagos tratados con interferón gamma (IFNγ) y bacteriano lipopolysaccharide (LPS), señalado M (IFNγ + LPS), que contribuyen a la respuesta inflamatoria; 2) macrófagos estimulados con interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), que se asocian con la respuesta de curación; 3) macrófagos estimulados con complejos inmunes (CI) y LPS, M (IC + LPS), que tienen la capacidad para apagar la respuesta inflamatoria2,3. M (IC + LPS) son distinto de los macrófagos de la cicatrización M(IL-4) y no expresan la arginasa (Arg-1) de la enzima o FIZZ14. El mejor marcador para estos macrófagos antiinflamatorios es la producción del cytokine del5. Los macrófagos tienen múltiples funciones en el mantenimiento de la salud, pero también contribuyan a enfermedades inflamatorias y cáncer3. Por esta razón, los macrófagos son una diana terapéutica clave para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Es importante investigar los efectos de los anticuerpos sobre su estado de activación para desarrollar tratamientos a base de macrófagos para la enfermedad.
El enfoque de este artículo es sobre el uso de macrófagos murinos la médula ósea derivado (BMDMs) y los macrófagos peritoneales para probar el efecto de fármacos de anticuerpos en las respuestas inflamatorias in vitro e in vivo. Recientemente, ha habido varios estudios que demuestran los efectos de anticuerpos macrófago activación6,7,8. Macrófagos activados conjuntamente con complejos inmunes, que son anticuerpos complejados con un antígeno y LPS, un estímulo inflamatorio normalmente, producen niveles muy altos de la citocina antiinflamatoria IL-10 y niveles muy bajos de la citocina proinflamatoria, Interleucina 12 (IL-12)9. Además, infliximab, un anticuerpo monoclonal contra el TNFα, se ha encontrado para trabajar, en parte, mediante la inducción de macrófagos antiinflamatorios a través de su fragmento cristalizable (Fc) región7. Nos han informado que la IgIV + LPS inducen activación de macrófagos antiinflamatorio similar a M (IC + LPS), en donde co estimulados macrófagos producen grandes cantidades de IL-10 y cantidades bajas de la subunidad de citoquinas pro-inflamatorias interleuquina 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleucina 6 (IL-6) y TNF8. Inmunoglobulina intravenosa es un fármaco compuesto de anticuerpos policlonales, principalmente IgG, que ha sido de la sangre de los donantes más de 1.00010. Se utiliza para tratar una amplia variedad de Enfermedades inmunológicas, como la púrpura trombocitopénica idiopática y la polineuropatía desmielinizante crónica, pero su mecanismo de acción no es completamente entendida11. Los efectos de drogas de anticuerpos basados en la activación de los macrófagos pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en este documento.
Los efectos de productos biológicos específicos en la activación de los macrófagos se pueden probar en BMDMs y en los macrófagos peritoneales. Utilizando estas fuentes de macrófagos permite la evaluación de células primarias. Pruebas preliminares de anticuerpos en cultivos de células primarias requiere menos tiempo y la inversión monetaria que otros modelos de enfermedad desperdiciador de tiempo y costoso. Por inyectar un medicamento en un ratón sano en vivoy aislar las células y análisis ex vivo, uno puede determinar si los estudios están garantizados para evaluar si el tratamiento con productos biológicos afecta la activación de los macrófagos en modelos de la enfermedad.
Con pocos estudios el efecto de las terapias biológicas en la activación de macrófagos in vitro e in vivo la prueba directamente, nuestras técnicas proporcionan una ventaja sobre técnicas alternativas. Las técnicas actuales implican efectos de droga biológica prueba de mezclado de la célula poblaciones en vitro, por ejemplo el efecto de infliximab en una reacción linfocitaria mixta (MLR) o inmunoglobulina intravenosa en macrófagos humanos en células mononucleares de sangre periférica, donde el efecto no se puede atribuir a una célula específica tipo7,12. Uso de BMDMs y macrófagos peritoneales es ventajoso sobre el uso de líneas celulares, tales como 264.7 células, que no producen las citoquinas pro inflamatorias, IL-12, en respuesta a LPS8,13. Prueba el efecto de una droga basada en anticuerpos en macrófago respuestas ex vivo tiene ventajas porque las respuestas del cytokine pueden atribuirse directamente a los macrófagos, en lugar de inferir las respuestas de los macrófagos mediante la medición de niveles del cytokine del suero14 . BMDMs y macrófagos peritoneales pueden ser derivados y aislados de ratones modificados genéticamente para determinar el papel específico de una proteína de activación de los macrófagos antiinflamatorio. Por ejemplo, hemos utilizado Il10 deficiente(- / -) BMDMs para demostrar que la reducción inducida por la inmunoglobulina intravenosa de la producción de citoquinas pro-inflamatorias es parcialmente dependiente de IL-108. Mecanismo de un medicamento de acción puede ser investigado utilizando el borrar occidental, donde el papel de proteínas específicas y eventos de señalización puede ser determinado. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) puede realizarse en BMDMs o los macrófagos peritoneales muestran patrones de expresión génica que resultan de la activación de anticuerpos. Modelos de la enfermedad en ratones pueden proporcionar información sobre la potencial eficacia de las terapias biológicas basados en anticuerpos en modelos para enfermedades como la inflamatoria intestinal enfermedad de, artritis reumatoide y cáncer15,16, 17. sin embargo, las técnicas descritas aquí proporcionará información sobre el mecanismo de acción de estos productos biológicos determinando si inducen la actividad de los macrófagos antiinflamatorio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1312px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12440053</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td>
			<td style="width:209px;">Stemcell technologies</td>
			<td>78059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Monothioglycerol (MTG)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma</td>
			<td>88640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1X red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:209px;">eBioscience</td>
			<td style="width:408px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">13150016</td>
			<td>Enzyme-Free, Hanks&#39;s-based, EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma aldrich</td>
			<td style="width:408px;">L 4516</td>
			<td>From E. coli 0127:B8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammunex)</td>
			<td style="width:209px;">Grifols</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammagard liquid)</td>
			<td style="width:209px;">Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Octagam)</td>
			<td style="width:209px;">Octapharma</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-10 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-12/23p40 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-Erk1/2 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-pp38 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:209px;">Fitzgerald industries</td>
			<td style="width:408px;">10R-G109A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">26 g needle</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td style="width:209px;">Diamed</td>
			<td style="width:408px;">SPE155-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:453px;">75 cm2 tissue culture treated flask</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forcepts</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td>fine tip, dissecting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">Scissors</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td>Delicate, 4 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:209px;">Motic</td>
			<td style="width:408px;">AE31</td>
			<td>Inverted phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Scale&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Mettler&#160;</td>
			<td style="width:408px;">PE 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

Los macrófagos son las células inmunes innatas fagocíticas, que inician la respuesta inmune a patógenos y contribuyan a la restitución del tejido y cicatrización. Los macrófagos son igualmente importantes en la desactivación de las respuestas inflamatorias. Hemos demostrado que los macrófagos estimulados con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) pueden producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria, interleucina 10 (IL-10) y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos ( LPS). IVIg es que un anticuerpo polivalente, principalmente inmunoglobulina Gs (IgGs), agrupados desde el plasma de más de 1.000 donantes de sangre. Se utiliza para complementar los anticuerpos en pacientes con inmunodeficiencias o para suprimir la respuesta inmune en pacientes con enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Infliximab, un factor terapéutico antifactor de necrosis tumoral alfa (TNFα) anticuerpo, también se ha demostrado para activar a los macrófagos a producir IL-10 en respuesta a estímulos inflamatorios. Inmunoglobulina intravenosa y otros productos biológicos basados en anticuerpos pueden analizarse para determinar sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Este artículo describe métodos para la derivación, la estimulación y la evaluación de los macrófagos de médula ósea murina activados por los anticuerpos en vitro y macrófagos peritoneales murinos activados con anticuerpos in vivo. Por último, se demuestra el uso de western blot para determinar la contribución de la señalización de caminos hacia la actividad de los macrófagos antiinflamatorios específicos de la célula. Estos protocolos se pueden utilizar con ratones genéticamente modificados, para determinar el efecto de una proteína específica sobre la activación de macrófagos antiinflamatorio. Estas técnicas pueden usarse para evaluar si determinados productos biológicos pueden actuar cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatorio de producción de IL-10 que reduce las respuestas inflamatorias en vivo. Esto puede proporcionar información sobre el papel de la activación de los macrófagos en la eficacia de productos biológicos en modelos de la enfermedad en ratones y proporcionar la penetración en un nuevo mecanismo de potenciales de acción en las personas. Por el contrario, esto puede precaución contra el uso de productos biológicos basados en anticuerpos específicos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente si los macrófagos juegan un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por esa.

Macrófagos de derivados de médula ósea murina pueden cultivarse a partir de precursores de células hematopoyéticas en aspirados de médula ósea. Aspirados de médula ósea agrupados de fémures y tibias de un ratón C57BL/6 por lo general rinden 107 médula ósea derivado de macrófagos, haciéndolos una fuente conveniente de los macrófagos para experimentos. BMDMs pueden ser utilizados para probar las respuestas del medicamento anticuerpo basado en cuando con un estímu...

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K vistas.  University of British Columbia. Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigación

Inmunología e Infección

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb largo Bone La disección y el aislamiento de médula ósea

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Resumen

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