Este experimento destaca el valor terapéutico del anticuerpo Anti-c-fms en enfermedades de la alteración ósea inflamatoria, como la artritis reumatoide y la periodontitis. El proceso por el cual se extrae la médula ósea y se utiliza para generar precursores osteoclastos, produce grandes cantidades de osteoclastos puros, que se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores. Este protocolo proporciona dos métodos alternativos de osteoclastogénesis, ya sea utilizando el ligando RANKL o TNF alfa.
Además de eso, este método proporciona información sobre el efecto del anticuerpo Anti-c-fms en la osteoclastogénesis. La demostración visual de este procedimiento familiariza al investigador con el proceso de disección y obtención de células de médula ósea en grandes cantidades. Para comenzar a llenar una placa que servirá como un contenedor de recogida con aproximadamente 50 mililitros de MEM alfa, dependiendo del tamaño del recipiente, y colocarlo en hielo.
Utilice alfileres para perforar a través de las palmas y los pies de un ratón eutanizado para fijarlo en posición supina, y rocíe a fondo con 70% de etanol. Usa tijeras y pinzas quirúrgicas estériles para hacer una incisión cutánea a nivel de la cadera y extenderla hasta los pies, exponiendo los músculos. Localice y corte el tendón que une el músculo del cuádriceps.
Pelar el músculo y cortarlo a la altura de la cadera. A continuación, localice el tendón que une el músculo isquiotibial al hueso. Pelar los músculos que exponen el hueso, y liberar el isquiotibial de su apego, asegurándose de no cortar en el hueso.
Coloque las tijeras entre la cabeza del fémur y el espacio de la articulación. Cortar en él liberando el fémur, pero manteniendo el hueso intacto, lo que permitirá el desprendimiento de los huesos sin riesgo de exponer la médula ósea. Corta los músculos unidos a la tibia de una manera similar.
A continuación, cortar la tibia libre de su fijación en la articulación del tobillo, manteniendo el hueso intacto para evitar la contaminación. Utilice las cuchillas de tijera y las toallitas de laboratorio para raspar cualquier tejido blando restante del fémur y la tibia y colocarlos en la placa preparada con meM alfa colocado en el hielo. La disección debe llevarse a cabo cuidadosamente para minimizar la contaminación.
Es por eso que la eliminación exhaustiva de tejidos blandos y la localización ósea son cruciales. Llene una jeringa de aguja de calibre 30 con MEM alfa. Desconecta la tibia y el fémur lejos de la articulación de la rodilla, y corta los extremos del hueso largo de ambos lados usando tijeras.
Use pinzas para sujetar el hueso del eje. Inserte la aguja en el espacio de la médula hasta el hueso y enjuague lentamente el contenido de la médula en un plato de cultivo de seis centímetros y repita para todos los huesos. El hueso se volverá blanco, lo que indica la extracción de todo el contenido de médula ósea.
Utilice un colador de células de nylon de 40 micrómetros para colar el extracto de médula ósea en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.
Para lavar, agregue cinco mililitros de MEM alfa al pellet. Pipetear las células para separarlas, centrífuirlas y repetir el lavado un total de dos veces. Después de contar estas células aisladas, como se describe en el manuscrito, siembra 10 millones de células por cada 10 mililitros, en un plato de cultivo de 10 centímetros, y agrega M-CSF a las células.
Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante tres días. Retire el medio después de tres días, y lave las células dos veces vigorosamente con 10 mililitros de PBS para eliminar las células no adherentes. Añadir cinco mililitros de temperatura ambiente 0.02%trypsin-EDTA y PBS, e incubar a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante cinco minutos.
Pipetear a fondo las células para separarlas. Observe el cultivo bajo un microscopio para asegurarse de que las células se han desprendido y aparecen redondeadas y flotantes en los medios. Cuando las células se hayan desprendido, inactivar la reacción añadiendo cinco mililitros del MEM alfa.
Recoger las células en un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, lavar con cinco mililitros de MEM alfa, y centrifugar de nuevo a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de MEM alfa.
Siembra 1 millón de células por cada 10 mililitros en un plato de cultivo de 10 centímetros, y añade M-CSF. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante tres días. Cosecha las células adheridas, que representan los MMM como precursores osteoclastos después de tres días, como se hizo anteriormente durante la generación de MMM.
Siembra los MDM a 50.000 células por cada 200 micro litros de MEM alfa en una placa de 96 pozos por pozo. A cada pozo, añadir estímulos deseados. Y luego añadir M-CSF para una concentración final de 100 nanogramos por mililitro.
Añadir anticuerpo Anti-c-fms a cada pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante cuatro días, mientras cambia de medio cada dos días durante cuatro días. Y luego proceder con la tinción y los ensayos, como se describe en el manuscrito.
Se evaluó la formación de osteoclastos en el cultivo tratado con M-CSF y RANKL, con anticuerpos Anti-c-fms. Con 101.000 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, se observó una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control. Mientras que, con uno de cada 10 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, no hubo una disminución significativa.
Luego, se evaluó la formación de osteoclastos en el cultivo alfa tratado M-CSF y TNF, con anticuerpos Anti-c-fms. Con 10, 100, 1.000 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, se observó una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control, sin una disminución significativa en un nanogratro por mililitro. Y el cultivo M-CSF con 1, 10, 100 nanogramos por mililitro Anti-c-fms anticuerpo, no hubo una disminución significativa en el número de precursores osteoclastos en comparación con el control.
Sin embargo, a 1.000 nanogramos por mililitro, hubo una disminución significativa en el número de precursores osteoclastos, lo que indica que se necesita una concentración de hasta 1.000 nanogramos por mililitro para inhibir significativamente la proliferación de precursores osteoclastos. Asegúrese de liberar los enlaces mientras mantiene el hueso intacto, lo que minimizará la posibilidad de contaminación.
