Apoyo por la NSF (EPSCoR EPS-0814251) y NIH (1P20GM103653-01A1) MKT y HSD, apoyo al estudiante institucional de la Universidad Estatal de Delaware a MDM (título III HBGI) y KRS (NIH-INBRE) se agradece. Gracias al centro de genética de C. elegans (apoyado por el Oficina de NIH de investigación infraestructura programas P40 OD010110) para tensión de N2 de tipo salvaje de C. elegans .

Protocolos que se indican a continuación han sido estandarizados para probar los efectos de la exposición BPA durante la embriogénesis temprana y pueden ser modificados para su uso con BPS, BPF o interruptores endocrinos y tóxicos en C. elegans embriones.
1. material instalación
<ol><li>Disolver 1,5 g de NaCl, 1.25 g de peptona y 8,5 g de agar en el agua a 500 mL para preparar 500 mL de medio de18 medios de crecimiento de nematodos (NGM). Después de la esterilización en autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 minutos), Añadir 0.5 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M de CaCl2 y 12,5 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g de K2HPO4, agua 1 L).</li>
	<li>Preparar solución de hipoclorito al mezclar 25 mL de 1 KOH de N, 4 mL de lejía y 71 mL de agua. Hacen de esta solución fresca.</li>
	<li>Preparación de Buffer M9 mezclando 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4y el agua a 1 L.</li>
	<li>Preparar el tampón S18 mezclando 129 mL de 0,02 M K2HPO4, 871 mL de KH2PO4y 5,85 g de NaCl.</li>
	<li>Esterilice en autoclave los buffers M9 y S.</li>
	<li>Cultivar una cultura noche de Escherichia coli (cepa 50 OP) en 20 mL de caldo Luria (LB).</li>
	<li>BPA se disuelven en etanol al 10% para hacer una solución stock de 1 mM. Hacer diluciones subsecuentes de 0.1 μm, 0,5 μm, 1 μm, 5 μm y 10 μm en tampón de S. Nota: Dilución en el búfer de S acuoso reduce la concentración de etanol; por ejemplo, en la mayor concentración de BPA que se describe en este protocolo (10 μm), la concentración de etanol es 0,1% v/v.</li>
</ol>2. cultivo de C. elegans y sincronización
<ol><li>Vierta los medios NGM en placas de 100 mm (aproximadamente 25 mL/placa) y deje que se solidifique. Una vez solidificado, semilla las placas separando 150 μL de e. coli OP50 del cultivo líquido crecido durante la noche. Incube las placas a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, traslado gusanos de N2 en las nuevas placas en trozos una losa aproximada de cuadrado de 1 cm. Permiten gusanos crecer durante 3 días a 20 ° C hasta que la placa está poblada con adultos maduros bien alimentados que contienen embriones visibles.</li>
	<li>Para sincronizar, lave cada placa mediante pipeteo hasta 5 mL de buffer M9 en la placa. Transferir el líquido a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril. Nota: La sincronización se realiza para matar a gusanos adultos y recoger embriones que son relativamente el mismo escenario.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g durante 4 min a temperatura ambiente para obtener un pellet suelto de gusanos adultos.</li>
	<li>Con una pipeta de 10 mL, retire con cuidado el sobrenadante para dejar intacta la pelotilla. Añadir 5 mL de la solución de hipoclorito y mezclar suavemente.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 4 minutos.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL y lavar con 7 mL de buffer M9. Repita este paso dos veces.</li>
</ol>3. exponer los gusanos a BPA
<ol><li>Después del último lavado de paso 2.7 anterior, suspender cerca de 100 μl de huevos con buffer M9. Transferir aproximadamente 50 μl de los huevos a los tubos del microfuge 2 mL ya que contienen la concentración adecuada que BPA diluido en tampón de S. Ajustar la cantidad de S-buffer para asegurar la correcta concentración final de BPA (μm 0.0, 0.1 μm, 0,5 μm, 1.0 μm, 5.0 μm y 10 μm) por el tubo. Tabla 1 ilustra una forma de hacer las diluciones.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Para la concentración de BPA Final</td>
			<td>Acción BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Gusanos de sincronizada</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>850 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Acción BPA, S buffer y sincronizados gusanos utilizados para alcanzar las concentraciones deseadas utilizadas para nuestro estudio.
<ol start="2"><li>Colocar tubos en una coctelera y agite suavemente durante 4 horas a 20° C, a 25 rpm para un agitador rotatorio o inclinaciones 25/min para un agitador oscilante.</li>
	<li>Después de 4 h, colocar tubos en los titulares de tubo y gusanos resolver.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y transferir gusanos a placas (NGM con OP50 e. coli). Hacer el cultivo líquido OP50 e. coli según lo indicado en 1.5 y las placas de la semilla como se indica en 2.1.</li>
	<li>Dejar las gusanos crecer durante 60 horas en 20 ° C. Examinar las placas de todos los días de contaminación. Contaminados planchas NGM son generalmente descoloridas y acompañados de colonias individuales. Ver gusanos bajo el microscopio para masificación. La falta de césped OP50 e. coli y gusanos concentrados en pequeñas manchas significa hacinamiento.</li>
</ol>4. anterior toque habituación ensayo
<ol><li>Transferir a aproximadamente 10 jóvenes sincronizados recoger gusanos adultos a nuevas placas NGM no sembradas usando un alambre de platino 30 G esterilizados por fuego. Deje reposar durante 5 minutos permitir que los gusanos de tiempo para aclimatarse a la nueva placa.</li>
	<li>La respuesta de habituación, utilice un pelo de ceja atado al extremo de un pincho de madera o palillo de dientes y esterilización por inmersión en etanol al 70%. Limpie con un paño limpio libre de pelusas y esperar 1 minuto para el etanol se evapore apagado. Toque suavemente el gusano en la cabeza (parte anterior del bulbo faríngeo) con el pelo de la ceja. Repita los toques, permitiendo 10 s entre toques para permitir que el gusano recuperar.</li>
	<li>Continuar al tacto (permitiendo intervalos interstimulus de 10 s) hasta que el gusano ya no se mueve hacia atrás. En este punto, el gusano ha habituado al estímulo. Anotar el número de toques para el gusano a habituarse.</li>
	<li>Analizar la diferencia entre las tasas medias de habituación de los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey.</li>
</ol>5. gusano fecundidad ensayo
<ol><li>Traslado individual L3 gusanos a un plato fresco y semillas usando una selección platino. Asegúrese de que sólo un gusano esté colocada por placa. Nota: después de la etapa larval L3, gusanos se convierten en larvas L4 y la edad adulta. Recolección temprana es conveniente en que son lo suficientemente grandes como para el traslado de los individuos asegurando que han no ya pusieron los huevos que de lo contrario sería faltados en la cuenta.</li>
	<li>Contar el número de huevos puestos cada 12 – 24 h. Después de contar, transferir el gusano de los padres a una nueva placa. Repita hasta que el gusano deja de poner huevos, por lo general después de 5 días cuando se incubaron a 20 ° C. Nota: en promedio, un gusano de tipo salvaje puede poner hasta 300 huevos; por lo tanto, transferir al padre a una nueva placa diariamente evita el hacinamiento.</li>
	<li>Analizar la diferencia entre el número promedio de huevos puestos por los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Fases de rápido crecimiento y desarrollo como la embriogénesis son particularmente vulnerables a los efectos perjudiciales de distintos compuestos interrumpiendo endocrinas, incluyendo BPA. Ofrecemos protocolos detallados para estudiar los efectos de exposición a BPA u otras sustancias tóxicas en el modelo de invertebrado C. elegans , que permite la valoración conveniente de una gama de concentraciones a evaluar su efecto sobre la viabilidad del embrión (figura 2) . Seguimiento de experimentos conductuales en sobrevivientes adultos que desarrollan a partir de embriones que fueron expuestos a bajas dosis de BPA permite ensayo a largo plazo efectos sobre la función neuronal (figura 3). La idea central de este trabajo es proporcionar protocolos detallados para la exposición de embriones a varias sustancias tóxicas durante el período de embriogénesis temprana en el modelo de C. elegans ; la primera ventana de 4 h de su período de desarrollo embrionario de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde al período de proliferación, que es seguido por organogénesis. Hacia este fin, se facilita la validación de los puntos finales a través de análisis de aprendizaje no asociativo y fecundidad. Mientras que la base mecanicista de la acción de BPA y otros bisfenoles es el Santo Grial hacia donde se dirige la investigación en este campo, tenemos intento ofrecer una explicación mecanicista de la acción de BPA en este artículo de metodología enfocada. Sin embargo, nos gustaría señalar que la C. elegans es un sistema ideal para diseccionar más el mecanismo de acción. Por ejemplo, en un futuro trabajar en descifrar los mecanismos de acción de BPA, mutantes de C. elegans pueden ser generadas y defienden para la resistencia a los efectos del BPA y así allanan el camino para descifrar el camino. Además, nuestro papel de compañero aborda el efecto del BPA a nivel de sincronía de red neuronal en vertebrados, proporcionando otra vía para entender las bases para investigar mecanismos potenciales para efectos tóxicos19.
En la metodología detallada en este documento, algunos de los pasos críticos que deben ser ejecutaron extra cuidadosamente los siguientes: elegir un plato bien alimentados de C. elegans adultos con huevos maduros visibles debajo del microscopio de disección es crucial, y no seguir este paso dará como resultado un tamaño de muestra suficiente de embriones para el experimento de exposición EDC. También es importante asegurarse de que la solución de hipoclorito se realiza fresca para evitar la obtención de una población no sincronizada que interfiera con la capacidad para llevar a cabo la exposición BPA durante la embriogénesis temprana. Lavado de pellets con M9 (después de la exposición de hipoclorito) también es un paso muy importante. Si no se realiza correctamente, la alta concentración de cloro podría producir embriones muertos. Además, los embriones deben transferirse a sembrados NGM de placas después de 4 h. Si en la solución BPA para un período prolongado de tiempo, los embriones son propensos a desarrollar en las larvas de larga duración dauer. Esto interferirá significativamente con análisis de comportamiento y análisis de la fecundidad. Si olvida cualquiera de estos pasos, es aconsejable iniciar el procedimiento desde el principio. Si por cualquier motivo, la placa NGM con gusanos está contaminada o no tiene suficiente comida, agrega estrés sobre los gusanos de tal modo sesgando los datos recogidos. Tales placas deben ser desechados y no ser utilizados en el experimento.
Previamente, un estudio notable utilizado con éxito el modelo de C. elegans para demostrar que anormalidades del cromosoma causaron por resultado BPA debido a la descomposición de la maquinaria de reparación del ADN en la línea germinal14. Sin embargo, cabe destacar que el diseño del estudio anterior había utilizado continua exposición BPA de C. elegans a altas dosis de BPA durante toda su vida. Nuestra metodología fue diseñada para el estudio de bajas dosis de exposición BPA durante la embriogénesis temprana, con el fin de analizar sus efectos en la viabilidad embrionaria y sutiles efectos a largo plazo en los sobrevivientes. A nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ninguna metodología para exponer embriones de etapa temprana a muy baja dosis de BPA durante un periodo especificado de tiempo; por lo tanto, lo que el método había presentado aquí novela.
Además, protocolos proporcionan aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar los efectos de otros interruptores endocrinos durante la fase de proliferación de la embriogénesis. Sin embargo, para estudiar las últimas etapas embrionarias, el protocolo requiere modificaciones claves en la ventana de tiempo crítico de desarrollo bajo enfoque. Además, nuestro protocolo no será adecuado para los experimentos que requieren tiempos más largos de exposición a sustancias tóxicas, como abre la posibilidad de la vía de desarrollo alternativo dando por resultado la detención de larga duración dauer en el segundo ciclo de muda, que es resistente a la a las duras condiciones20. Otras modificaciones y mejoras serán necesario por más tiempo de exposición a través del suplemento con una fuente de alimento que no tiene potencial para metabolizar la sustancia tóxica o por ejemplo EDC esterilizado e. coli. En conclusión, nuestra metodología puede ser utilizada para evaluar los efectos de varios endocrinos interrumpir productos químicos en la fecundidad y en la función neuronal en el sistema modelo de invertebrado C. elegans.

Exposición a tóxicos ambientales, particularmente compuestos aquellos que tienden a interferir con el desarrollo, ha estado bajo escrutinio científico cuidadoso en los últimos años. Más de 1 mil productos químicos de uso diario se clasifican en endocrinas interrumpir compuestos (EDC)1. Periodos de rápido crecimiento y desarrollo, que incluyen el embrionario, infantil y etapas de la infancia, se han observado para ser particularmente vulnerables a los efectos nocivos a dosis incluso bajas EDC. Han demostrado su efecto a causa de trastornos reproductivos y del desarrollo neurológico2. Por las directrices de panel nos Agencia de protección ambiental y el programa nacional de Toxicología de Estados Unidos, una dosis baja puede definirse como cualquier dosis por debajo del nivel de uno que se ha divulgado para causar un cambio biológico observable o daño3. Además de efectos de dosis bajas de los EDCs, mezclas de varias EDCs encontradas bajas concentraciones en el medio ambiente tienen el potencial para causar efectos acumulativos sustantivas4.
Bisphenol A (BPA o 4,4'-(propane-2,2-diyl)) es un agente de polimerización en artículos comúnmente usados tales como botellas de agua, recibos de almacén, selladores dentales y las guarniciones de bebidas y latas de alimentos5. Debido a su similitud estructural con el Estradiol 17-β (E2) y su afinidad a los receptores de estrógenos ERα y ERβ, el BPA ha sido clasificada como un endocrino interrumpir química (EDC)5,6. Aunque más débil, afinidad de BPA a los receptores de estrógenos se ha demostrado para afectar el sistema de reproducción de ambos sexos y alterar funciones neuronales en las dosis que se consideran seguros7,8. Se han observado cambios en la metilación del ADN a través de mecanismos epigenéticamente regulados para causar defectos neuronales a largo plazo en ratones expuestos a BPA9. Específicamente, el BPA también se ha implicado como un posible culpable de aumento de las tasas de hiperactividad, deficiencia de atención y aumento de la sensibilidad a los medicamentos debido a un aumento observado en los receptores de dopamina D1 en el forebrain limbic del ratón después de la exposición crónica 9 , 10. evidencia significativa sobre los efectos deletéreos de los interruptores endocrinos en la salud humana se basa en estudios de correlación, centrándose principalmente en la exposición crónica de la población a sustancias tóxicas ambientales incluso en dosis bajas5; sin embargo, limitaciones en deducciones de estudios en humanos y en la manipulación de controles experimentales han sido aceptados al abordar las críticas de exageraciones sin fundamento11,12.
Debido a la conservación de genes de Caenorhabditis elegans con respecto a los mamíferos, incluyendo sus genes del receptor de la hormona esteroide, los investigadores han utilizado este modelo de laboratorio genéticamente manejable para desentrañar los efectos funcionales y mecánicos de EDCs 13. experimentos con C. elegans han demostrado que estos compuestos como BPA y BPS pueden causar apoptosis, mortalidad embrionaria, alteración en los mecanismos de reparación de rotura de ADN de doble hebra y función neural14,15 ,16.
Nuestro laboratorio ya ha demostrado que incluso dosis bajas de exposición limitada a embriogénesis temprana conduce a baja fecundidad con déficits conductuales en los sobrevivientes adultos15. Habituación a un estímulo repetido es una forma de aprendizaje asociativo en sistemas modelo, como C. elegans, y nuestra metodología utiliza esta forma de aprendizaje asociativo como una salida de comportamiento para analizar los efectos a largo plazo de la exposición embrionaria a las sustancias tóxicas17 específicamente, proporcionamos protocolos detallados para estudiar la exposición al BPA en C. elegans, incluyendo sus efectos inmediatos sobre la mortalidad embrionaria y efectos a largo plazo en el comportamiento del adulto, con un esquema general en Figura 1. Resultados representativos de fecundidad y de ensayos de aprendizaje no asociativo se proporcionan para destacar la eficacia de nuestra metodología.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisfenoles, como el Bisfenol A (BPA) y bisfenol S (BPS) polimerización a agentes ampliamente utilizados en la producción de plásticos y numerosos productos de uso cotidiano. En su estructura química y propiedades biológicas estradiol-como base, han sido clasificados como endocrino interrumpir compuestos (EDC). La exposición prolongada a interruptores endocrinos, incluso en dosis bajas, se ha relacionado con varios defectos de salud, incluyendo cáncer, trastornos conductuales e infertilidad, con mayor vulnerabilidad indicado durante períodos tempranos del desarrollo. Estudios celulares y moleculares con el modelo genéticamente manejable de nematodo elegans de Caenorhabditis han demostrado que la exposición al BPA provoca apoptosis, mortalidad embrionaria y alteración en el ADN mecanismos de reparación. Hemos divulgado previamente que la exposición de embriones de C. elegans a dosis bajas de bisfenoles diferentes disminuye fecundidad. Además, hemos demostrado que los efectos de la exposición durante las primeras etapas del desarrollo persisten en la edad adulta como ensayaron por cuantificar el comportamiento de la habituación, una forma de aprendizaje asociativo. Aquí, le ofrecemos protocolos detallados para la exposición embrionaria a EDCs dosis bajas así como de la fecundidad asociada y anterior toquen ensayos de habituación, junto con resultados representativos.

Estudios anteriores con C. elegans han reportado que la exposición continua a altas concentraciones de BPA (≥1 mM) a lo largo de desarrollo del embrión y la edad adulta disminuye fecundidad14. Estudios posteriores de nuestro laboratorio han demostrado que los embriones que han sido expuestos a BPA durante un período limitado de 4 h en las primeras etapas de su desarrollo demostrada una disminución en el número de huevos viables puso como adultos15 (figura 2). Dos características clave de la metodología eran que (i) las concentraciones de BPA usadas significativamente menor (0.1 μm Rango μm 10) y (ii) la exposición fue limitada al período embrionario temprano. Además de fecundidad disminuida incluso a dosis más bajas, nuestros ensayos de habituación revelaron que gusanos expuestos a BPA como embriones necesarios más estímulos para ser habituado comparado con gusanos exponen al vehículo solo15 (figura 3). Estos efectos son notables en que se basan en la exposición BPA de dosis baja, siguiendo la lógica que efectos más sutiles en la función neuronal que no pueden ser morfológicamente evidente están probable que sean discernibles a través de cambios de comportamiento. En Resumen, los resultados representativos presentan subrayado el hecho de que los efectos perjudiciales de la exposición BPA a un embrión afecta su desarrollo, incluyendo la función neuronal que puede evaluarse mediante ensayos de comportamiento adulto en C. elegans. Protocolos que aquí pueden utilizarse para pruebas de baja dosis y largo plazo efectos de otras sustancias tóxicas potenciales incluyendo compuestos perturbadores endocrinos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática del diseño experimental. Los gusanos maduros fueron recogidos y expuestos a la solución de hipoclorito para la recolección de embriones sincronizados. Los embriones entonces fueron expuestos a diferentes concentraciones de BPA durante 4 horas. Los embriones expuestos fueron transferidos en las placas sembradas de NGM, donde se les permitió crecer de 60 h a 20 ° C. Para probar la eficacia de la exposición durante las primeras etapas de desarrollo, los gusanos de L4 se transfirieron a placas individuales y probados para la fecundidad, y adultos jóvenes fueron probados con tacto anterior habituación. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figura 2: fecundidad desciende por BPA. Exposición a 1 μm y mayores concentraciones de BPA disminuyó significativamente el número de huevos puestos en comparación con el control (representado por la línea horizontal; n = 10, *p < 0.05). Barras de error denotan SEM. análisis usando ANOVA, prueba post-hoc de Tukey. Esta figura ha sido modificada desde Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figura 3: efectos a largo plazo de la exposición BPA embrionaria se reflejan en el comportamiento adulto. Embriones expuestos a BPA concentraciones tan bajas como 0.1 μm afecta táctil anterior no asociativo habituación en adultos (n = 60, *p < 0.05). Barras de error denotan SEM; ANOVA, prueba post-hoc de Tukey. Esta figura ha sido modificada desde Mersha et al., 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Agudo, exposición a tóxicos ambientales puede afectar desarrollo con efectos a largo plazo. Protocolos detallados se proporcionan para ilustrar una estrategia utilizando un modelo eficaz de laboratorio para estudiar el efecto de la exposición embrionaria temprana a bisfenol A. Ofrecemos Análisis de comportamiento para monitorear la efectividad de nuestros bio-ensayos de exposición de sustancias tóxicas y fecundidad.

Consecuencias conductuales y reproductivas a largo plazo de exposición embrionaria a dosis bajas sustancias tóxicas

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K vistas.  Johns Hopkins School of Medicine. Agudo, exposición a tóxicos ambientales puede afectar desarrollo con efectos a largo plazo. Protocolos detallados se proporcionan para ilustrar una estrategia utilizando un modelo eficaz de laboratorio para estudiar el efecto de la exposición embrionaria temprana a bisfenol A. Ofrecemos Análisis de comportamiento para monitorear la efectividad de nuestros bio-ensayos de exposición de sustancias tóxicas y fecundidad.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma de perfiles de<em&gt; In-Vivo</em&gt; Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Consecuencias conductuales y reproductivas a largo plazo de exposición embrionaria a dosis bajas sustancias tóxicas

Resumen

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Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Usando

Transcriptoma de perfiles de

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

A largo plazo de imágenes en vivo

Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

Un método In Vivo para el estudio de integridad de barrera Hematotesticular ratón