NSF (EPSCoR EPS-0814251) tarafından destek ve NIH (1P20GM103653-01A1) MKT ve HSD, MDM (Başlık III HBGI) ve KRS (NIH-INBRE) Delaware State Üniversitesi Kurumsal öğrenci destek minnetle kabul edilmektedir. C. elegans C. elegans genetik (araştırma altyapı programları P40 OD010110 NIH Office tarafından desteklenen) Merkezi sayesinde vahşi tipi N2 süzün.

Aşağıda verilen iletişim kuralları etkileri BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDCs ve toxicants C. elegans embriyo üzerinde kullanılmak üzere değiştirilebilir.
1. malzeme Kur
<ol><li>Yuvarlak solucanlar büyüme medya (NGM)18 medya 500 mL 1,5 gr NaCl, pepton 1,25 g ve 8,5 gram agar 500 ml suda çözülerek hazırlayın. (121 ° C, 15 PSI, 20 dk) ısıyla sonra kolesterol (5 mg/mL etanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0.5 mL 1 M CaCl2 ve 1 M potasyum fosfat tampon, pH 7,4 (108.3 g KH2PO4 12,5 mL 0.5 mL ekleyin. K2HPO4, su 1 M'ye 35,6 g).</li>
	<li>Hipoklorit çözüm 1 N KOH 25 mL, çamaşır suyu 4 mL ve 71 mL su karıştırılarak hazır olun. Bu çözüm taze olun.</li>
	<li>M9 arabellek karıştırma KH2PO43 g, 6 g Na2HPO4, 5 gr NaCl, 5 mL su 1 M'ye ve MgSO41 m hazırlayın</li>
	<li>S arabellek18 0,02 M K2HPO4129 mL, KH2PO4871 mL ve NaCl 5.85 g karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>M9 ve S arabellekleri tarafından ısıyla sterilize.</li>
	<li>Bir gecede kültür Escherichia coli (OP 50 zorlanma) 20 ml Luria suyu (LB) büyümek.</li>
	<li>BPA 1 mM hisse senedi çözüm yapmak için % 10 etanol geçiyoruz. Sonraki dilutions 0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM S arabellekte olun. Not: Seyreltme sulu S arabellek etanol konsantrasyonu büyük ölçüde azaltır; Örneğin, bu Protokolü (10 µM) açıklanan en BPA yoğun etanol konsantrasyonu % 0,1 v/v olduğunu.</li>
</ol>2. C. elegans Culturing ve eşitleme
<ol><li>NGM medya (yaklaşık 25 mL/plaka) 100 mm kalıplara dökmek ve kuvvetlendirmek sağlar. Bir kez katılaşmış, tabakları E. coli OP50 gecede yetiştirilen sıvı kültüründen 150 µL yayarak tohum. Tabak 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, yaklaşık bir levha 1 cm karelik parçalama tarafından N2 solucanlar yeni plakalar üzerine aktarın. Solucanlar plaka görünür embriyo içeren iyi beslenmiş olgun yetişkin ile doldurulur kadar 20 ° C'de 3 gün boyunca büyümeye izin.</li>
	<li>Eşitlemek için her plaka plaka arasında en fazla 5 mL M9 arabelleği pipetting tarafından yıkayın. Sıvı bir steril 15 mL konik santrifüj tüpü aktarın. Not: Eşitleme yetişkin solucanlar öldürmek ve nispeten aynı sahne olan embriyo toplamak için yapılır.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 4 dk 3000 x g de yetişkin solucanlar gevşek bir Pelet elde etmek için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>10 mL pipet kullanarak, pelet olduğu gibi bırakmak böylece süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. 5 mL hipoklorit çözeltisi ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>3000 x g oda sıcaklığında de 4 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>10 mL pipet ile süpernatant kaldırmak ve M9 arabellek 7 mL ile yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın.</li>
</ol>3. solucanlar için BPA maruz
<ol><li>Yukarıda adım 2.7 gelen son yıkama sonra yumurta M9 arabelleği ile yaklaşık 100 µL askıya alma. Yaklaşık 50 µL yumurta 2 mL microfuge tüpler zaten BPA S arabellekte seyreltilmiş uygun konsantrasyon içeren aktarın. BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0.5 µM, 1.0 µM, 5.0 µM ve 10 µM) doğru son konsantrasyonu tüp ücret sağlamak için S-arabellek miktarını belirleyin. Tablo 1 bir yolu bu dilutions göstermektedir.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Son BPA konsantrasyon için</td>
			<td>Stok BPA (100 mikron)</td>
			<td>S arabellek</td>
			<td>Eşitlenmiş solucanlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 MİKRON</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>949 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 MİKRON</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>945 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 MİKRON</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>940 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 MİKRON</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>900 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 MİKRON</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>850 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hisse senedi BPA, S arabellek ve senkronize solucanlar çalışmamız için kullanılan istenen konsantrasyonları ulaşmak için kullanılan.
<ol start="2"><li>Bir shaker tüpler yerleştirin ve nazikçe 20 ° C'de, döner bir shaker için 25 rpm ya da sallanan bir shaker 25 Eğer/dk'ya 4 h için sallamak.</li>
	<li>4 h sonra tüpler tüp sahipleri yerleştirin ve solucanlar yerleşmek sağlar.</li>
	<li>Süpernatant atın ve solucanlar numaralı seribaşı Tabaklar (NGM tabaklar OP50 E. coliile) aktarın. Sıvı OP50 E. coli kültür 1,5 belirtildiği gibi yapmak ve tabakları 2.1 belirtildiği gibi temel olarak belirler.</li>
	<li>20 ° c 60 h için büyümek solucanlar izin Levhalar her gün kirlenme için inceleyin. Kirlenmiş NGM tabak genellikle renksiz ve bireysel koloniler tarafından eşlik etti. Aşırı kalabalık için mikroskop altında onay solucanlar. OP50 E. coli çim ve küçük spot renkleri de konsantre solucan eksikliği aşırı kalabalık anlamına gelir.</li>
</ol>4. ön Touch Habituation tahlil
<ol><li>Yaklaşık 10 eşzamanlı genç yetişkin solucanlar için bir yangın sterilize 30 G Platin tel kullanarak yeni seribaşı NGM plakaları almak aktarın. Solucanlar onlara izin vermek 5 min için rahatsız bekletin yeni plaka parkenizin vakti.</li>
	<li>Habituation yanıt için bir tahta şiş veya kürdan sonu iliştirilmiş bir kaş saç kullanın ve % 70 etanol daldırma tarafından sterilize. Temiz havsız bir doku ile silin ve etanol kapalı buharlaşır için 1 dk bekleyin. Solucan (faringeal ampul anterior) kafasına hafifçe dokun kaş saç kullanarak. 10 izin dokunuşlar, tekrar s arasında solucan kurtarmak izin vermek için dokunur.</li>
	<li>(10 s interstimulus aralıkları izin verir) solucan artık geriye doğru taşır kadar dokunmaya devam edin. Bu noktada, solucan için uyarıcı habituated. Solucan alıştırmak gerekli dokunuşlar kaydedin.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA Tukey'nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimlerini ortalama habituation oranları arasındaki fark analiz.</li>
</ol>5. solucan verimlilik tahlil
<ol><li>Bireysel L3 solucanlar bir taze ve numaralı seribaşı tabak Platin bir pick kullanarak aktarın. O sadece bir solucan plaka yerleştirildiğinden emin olun. Not: L3 larva aşamadan sonra solucanlar geliştirmek L4 larva sahne ve yetişkinlik. Onlar zaten kadar hangi başka türlü-sayıma özledim herhangi bir yumurta bırakırlar değil sağlarken bireysel hayvanlar transferi için yeterince büyük onları erken seçmek uygun olmamasıdır.</li>
	<li>Her 12-24 h koydu yumurta sayıları saymak. Sayım sonra üst solucan yeni bir tabağa aktarın. Solucan yumurtaları, genellikle 5 gün sonra durana kadar tekrar ne zaman 20 ° C'de inkübe Not: ortalama 300 yumurta bir vahşi türü solucan düzenleyebilirsiniz; Bu nedenle, üst yeni bir tabak için günlük aktarma aşırı kalabalık engeller.</li>
	<li>Tek yönlü ANOVA Tukey'nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimleri barındırmanın yumurta ortalama sayısı arasındaki farkı analiz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+Bisphenol+A+Levels+during+Pregnancy+and+Risk+of+Preterm+Birth.">Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth.</a> Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).</li><li>Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+and+the+great+divide:+a+review+of+controversies+in+the+field+of+endocrine+disruption.">Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption.</a> Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Hızlı büyüme ve embriyogenez gibi geliştirme aşamalarını BPA de dahil olmak üzere çeşitli endokrin engellemeden bileşikler zararlı etkilerini özellikle güvenlik açığından etkilenir. Detaylı iletişim kuralları, BPA veya diğer toxicants uygun titrasyon konsantrasyonları embriyo canlılık (Şekil 2) üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir dizi sağlar C. elegans omurgasız modelindeki maruz kalma etkileri eğitimi için sağlar . Davranışsal deney vardı BPA maruz düşük doz izin veren nöronal fonksiyon (şekil 3) üzerinde uzun vadeli etkileri raporlaması embriyo geliştirmek yetişkin kalan izleyin. Bu kağıt Merkez C. elegans modelindeki erken embriyogenez döneminde embriyolar için çeşitli toxicants maruz kalmaları için detaylı iletişim kuralları sağlamak için fikir; ilk 4 h penceresinde 11.5 saat embriyonik gelişim süresi (20 ° C'de) organogenesis tarafından takip nükleer silahların yayılmasına karşı döneme karşılık gelen. Bu amaçla doğru biz doğrulama verimlilik ve ilişkisel öğrenme deneyleri ile uç noktalarından sağladı. BPA ve diğer bisphenols eylem mekanik temeli olan doğru bu alanda araştırma hedefleniyor Kutsal Kase olmakla birlikte, BPA eylem bu metodoloji odaklı makalede için mekanik bir açıklama denemesi var. Ancak, C. elegans modeli daha fazla etki mekanizmaları incelemek için ideal bir sistem sunar işaret etmek istiyorum. Örneğin, gelecekte iş mekanizmaları BPA eyleminin deşifre C. elegans mutantlar oluşturulacak ve BPA etkileri bir direnç için ekranlı ve böylece yolu deşifre için önünü. Ayrıca, bizim arkadaş kağıt BPA omurgalılarda, yaydıkları etkileri19olası mekanizmaları araştıran için temel anlamak için başka bir avenue sağlayan neural ağ senkronizasyonu düzeyde etkisi ile ilgilidir.
Bu yazıda ayrıntılı metodoloji-meli var olmak kritik adımları bazı ekstra idam dikkatle şunları içerir: bir tabak iyi beslenmiş C. elegans ile seçme Yetişkin Olgun yumurta diseksiyon mikroskop altında görünür ile çok önemli, ve Bu adım takip etmek başarısız EDC pozlama deney için embriyo yetersiz örneklem büyüklüğü neden olur. Hipoklorit çözüm BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez gerçekleştirme olanağı çalışmasına engel eşitlenmemiş bir popülasyon alma önlemek için taze yapılmış olduğundan emin olmak önemlidir. M9 ile granül (hipoklorit maruz kaldıktan sonra) yıkama da çok önemli bir adımdır. Düzgün yapılmazsa, çamaşır suyu yüksek yoğunlukta ölü embriyoların neden olabilir. Ayrıca, embriyo numaralı seribaşı NGM plakaları için 4 h sonra aktarılmalıdır. BPA çözümde uzun bir süre için terk etseydi, embriyo uzun ömürlü dauer larva geliştirmek muhtemeldir. Bu önemli ölçüde verimlilik tahlil ve davranışsal deneyleri ile engel olacaktır. Bu adımlardan herhangi birini kaçırdıysanız, bu yordamı en başından başlamak için tavsiye edilir. Herhangi bir nedenle NGM plaka ile solucan bulaşmış mı veya yeterli yiyecek yok, böylece toplanan veriler eğriltme solucanlar üzerinde stres ekler. Böyle tabak atılmalıdır ve deneyde kullanılmayacak.
Daha önce dikkate değer bir çalışma başarıyla C. elegans modeli kromozom anomalileri arıza nedeniyle BPA sonucu DNA onarım makineleri germline14kaynaklanan göstermek için kullanılmıştır. Ancak, bu yukarıdaki çalışma tasarım C. elegans sürekli BPA maruz kalma BPA onun ömrü boyunca yüksek dozda kullanmış olduğu dikkat çekicidir. Metodolojimiz BPA maruz kalma düşük dozlarda, embriyonik canlılığı üzerindeki etkileri ve kurtulanların üzerinde ince uzun vadeli etkileri tahlil böylece erken embriyogenez sırasında çalışma için tasarlanmıştır. Bilgimizi, hiçbir metodoloji erken sahne embriyolar için belirli bir süre için sınırlı BPA çok düşük dozlarda ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir; Böylece, yapım yöntemi burada roman sundu.
Buna ek olarak, iletişim kuralları burada diğer EDCs etkileri nükleer silahların yayılmasına karşı embriyo aşamasında çalışmaya kolayca adapte olabilir sağladı. Ancak, geç embriyonik aşamada çalışma için protokol geliştirme odak altında kritik zaman penceresi için anahtar değişiklikler gerektirir. Dayanıklı ikinci molting döngüsü, içinde uzun ömürlü dauer tutuklama kaynaklanan alternatif kalkınma yolu olasılığını açılır gibi Ayrıca, bizim iletişim kuralı yaydıkları maruz kalma, daha uzun zaman gerektiren deneyleri için uygun olmayacaktır sert koşulları20' ye. Daha fazla değişiklik ve iyileştirmeler ile ilave toxicant veya EDC örneğin metabolize potansiyeline sahip değil bir besin kaynağı ile uzun pozlama süreleri için gerekecektir autoclaved E. coli. Sonuç olarak, metodolojimiz çeşitli endokrin kimyasallar verimlilik ve nöronal fonksiyon omurgasız modeli sistem engellemeden etkilerini değerlendirmek için kullanılması gereken C. elegans.

Çevre toxicants, maruz özellikle bileşikleri bu müdahale ile Geliştirme eğilimindedir, dikkatli bilimsel inceleme altında son yıllarda olmuştur. Günlük kullanım içinde binlerce kimyasal bileşikler (EDC)1engellemeden endokrin sınıflandırılır. Hızlı büyüme ve embriyonik, Bebek içerir geliştirme ve çocukluk dönemlerinde bile düşük doz EDC için zararlı etkilere özellikle savunmasız kalmaktan kaydetti. Onların etkisi gösterilmiştir üreme ve nörogelişimsel bozuklukları2neden olan. ABD Çevre Koruma Ajansı ve ulusal toksikoloji programı bize paneli yönergeleri düşük doz gözlemlenebilir bir biyolojik değişikliğe veya3zarar vermek için bildirilen bir seviyesinin altında herhangi bir doz olarak tanımlanabilir. Bireysel EDCs düşük doz etkileri yanı sıra çeşitli EDCs ortamında düşük konsantrasyonlarda bulundu karışımları maddi toplu etkileri4neden potansiyeline sahip.
Bisfenol A (BPA ya da 4,4'-(propane-2,2-diyl)) su şişeleri, mağaza girişleri, diş Dolgu macunları ve içecek balataları gibi sık kullanılan öğeleri bulunan bir polymerizing Ajan ve gıda kutular5. 17-β Estradiol (E2) için yapısal benzerlik ve onun benzeşme ERα ve ERβ östrojen reseptörleri nedeniyle, BPA kimyasal (EDC)5,6engellemeden bir endokrin sınıflandırması. Her ne kadar zayıf, BPA'ın benzeşme östrojen reseptörleri her iki cinsiyette üreme sistemini etkileyen ve güvenli7,8kabul edilen dozda sinir fonksiyonları bozabilir olduğu gösterilmiştir. DNA metilasyonu epigenetically düzenlenmiş mekanizmaları yoluyla değişimler BPA9' a maruz farelerde uzun vadeli nöronal hatalarına neden olduğu gözlenmiştir. Özellikle, BPA da hiperaktivite, dikkat eksikliği ve uyuşturucu kronik maruz kaldıktan sonra D1 dopamin reseptörleri fare limbik ön görülen artış nedeniyle artan duyarlılık artış oranları için olası bir suçlu olarak karıştığı olmuştur 9 , 10. EDCs insan sağlığı üzerinde zararlı etkileri üzerinde önemli kanıt korelasyon çalışmalar kronik teshir edilmesi bile, düşük doz5; çevre toxicants nüfusu çoğunlukla odaklanan temel alır Ancak, sınırlamalar çıkarımlar insan çalışmalar ve deneysel kontrolleri manipüle eleştiriler asılsız hype11,12hitap ederken kabul edildi.
Memelilerin açısından Caenorhabditis elegans genlerin korunması nedeniyle, dahil onun steroid hormon reseptör genleri, araştırmacılar bu genetik olarak uysal lab modelini EDCs fonksiyonel ve mekanik etkileri çözmeye kullanılan 13. C. elegans ile deneyler bu bileşiklerin BPA ve bit/sn gibi Apoptozis, embriyonik ölümcül, bozulma çift iplikçikli DNA ara tamir mekanizmaları ve sinirsel işlev14,15'neden olabileceğini göstermiştir ,16.
Bizim laboratuvar daha önce bile düşük doz pozlama için erken embriyogenez sınırlı kalan yetişkin15davranışsal açıkları ile indirdi verimlilik yol açar göstermiştir. Tekrarlanan bir uyarana habituation bir sigara ilişkisel öğrenme modeli sistem, C. elegans, dahil formudur ve metodolojimiz bu formu olmayan ilişkisel öğrenme embriyonik maruz uzun vadeli etkileri tahlil için bir davranış çıktı olarak kullanıp toxicants17 özellikle, biz ayrıntılı iletişim kuralları BPA maruz C. elegansembriyonik ölümcül hemen etkisi ve yetişkin davranışı üzerinde uzun vadeli etkileri ile içinde tasvir bir genel şematik de dahil olmak üzere üzerinde çalışmak için sağlar Şekil 1. Verimlilik ve ilişkisel öğrenme deneyleri temsilcisi sonuçları metodolojimiz etkinliğini vurgulamak için sağlanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisphenols, Bisfenol A (BPA) gibi ve Bisfenol S (BPS) plastik ve çok sayıda her gün kullanım ürünleri üretiminde yaygın olarak kullanılan ajanlar polymerizing. Kendi kimyasal yapısı ve östradiol benzeri biyolojik özellikleri dayalı, onlar bileşikler (EDC) engellemeden endokrin sınıflandırılmış. EDCs, uzun süreli maruz kalma düşük dozlarda bile, erken gelişim dönemleri sırasında gösterilen büyük güvenlik açığı ile kanser, davranış bozuklukları ve kısırlık, dahil olmak üzere çeşitli sağlık kusurları bağlı. Hücresel ve moleküler çalışmalar genetik olarak uysal nematodunun modeliyle Caenorhabditis elegans BPA maruz apoptosis neden olur, embriyonik ölümcül ve bozulma DNA'daki mekanizmaları onarım göstermiştir. Daha önce farklı bisphenols azalır verimlilik düşük doz bu maruz kalma C. elegans embriyo bildirdin. Buna ek olarak, biz pozlama geliştirme çok erken aşamalarında etkileri habituation davranış, bir form sigara ilişkisel öğrenme miktarının tarafından denetlesinler gibi yetişkinlik inat göstermiştir. Burada, embriyonik maruz kalma düşük doz EDCs yanı sıra ilişkili verimlilik ve ön detaylı iletişim kuralları ile birlikte temsilcisi sonuçları habituation deneyleri touch sağlamak.

C. elegans ile daha önceki çalışmalar yüksek BPA konsantrasyonları (≥1 mM) embriyo gelişimi ve yetişkinlik boyunca sürekli maruz kalma verimlilik14azalır bildirdi. Sonraki çalışmalar bizim laboratuardan rapor için BPA gelişimlerine uygun yumurta sayısı bir düşüş gösterdi, başlangıç evrelerinde 4 h sınırlı bir süre için maruz kalmış embriyo yetişkin15 (Şekil 2) koydu göstermiştir. Metodoloji iki temel özellikleri kullanılan (i BPA konsantrasyonları önemli ölçüde (10 µM Aralık için 0,1 µM) daha düşük ve (ii) maruz kalma erken embriyonik dönem için sınırlı olduğunu edildi. Daha düşük dozlarda bile, azalan verimlilik yanı sıra bizim habituation deneyleri embriyo solucanlar için karşılaştırıldığında habituated olmak için daha fazla bir çekim gücü gerektiği için BPA maruz solucanlar araç tek başına15 ' e (şekil 3) maruz ortaya koydu. Bu efektleri önemli düşük doz BPA maruz kalma, morfolojik belirgin olmayabilir nöronal fonksiyon üzerinde ince etkileri davranış değişiklikleri ayırt olmak muhtemeldir mantığı aşağıdaki temel vardır. Kısacası, temsilcisi sonuçları burada zararlı etkileri BPA maruz kalma bir embriyo gelişimi C. elegansyetişkin davranış deneyleri ile değerlendirildi nöronal işlevi de dahil olmak üzere, etkileri aslında alt çizgi sundu. Burada sağlanan protokoller endokrin yıkıcı bileşikler de dahil olmak üzere diğer potansiyel toxicants düşük doz yanı sıra uzun vadeli etkilerini test etmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel tasarım şematik gösterim. Olgun solucanlar toplanmış ve senkronize embriyo toplamak için hipoklorit çözüm için maruz. Embriyo sonra 4 h için farklı konsantrasyonları BPA maruz bırakıldı. Nerede 20 ° C'de 60 h için büyümeye izin verildi numaralı seribaşı NGM levha, maruz kalan embriyo transfer Geliştirme erken evrelerinde pozlama etkinliğini test etmek için L4 solucanlar için bireysel plakalar transfer ve verimlilik için test, ve genç yetişkinler ön dokunmatik habituation ile test edildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Şekil 2: verimlilik BPA tarafından indirdi. 1 µM ve daha yüksek konsantrasyonlarda BPA maruz önemli ölçüde koydu yumurta sayısı (yatay çizgiyle; temsil denetim kıyasla azalmıştır n = 10, *p < 0,05). Hata çubukları SEM ANOVA, Tukey'nın öğleden hoc testi kullanarak analiz göstermek. Bu rakam Mersha vd., 201515değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Şekil 3: embriyonik BPA maruz kalma uzun vadeli etkileri yetişkin davranışını yansıtılır. BPA konsantrasyonları 0,1 µM ilişkilendirilemez ön dokunmatik habituation yetişkin etkiler gibi düşük maruz embriyo (n = 60, *p < 0,05). Hata çubukları SEM göstermek; ANOVA, Tukey'nın hoc testi sonrası. Bu rakam Mersha vd., 201515değiştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants at JoVE.com

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Çevre toxicants maruz akut geliştirme uzun vadeli etkileri ile etkileyebilir. Detaylı iletişim kuralları Bisfenol A. için erken embriyonik pozlama etkisini incelemek için bir etkili lab modelini kullanarak bir strateji göstermek için sağlanan Sağladığımız verimlilik ve bizim yaydıkları pozlama biyo-deneyleri etkinliğini izlemek için davranışsal deneyleri.

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K Görüntüleme.  Johns Hopkins School of Medicine. Çevre toxicants maruz akut geliştirme uzun vadeli etkileri ile etkileyebilir. Detaylı iletişim kuralları Bisfenol A. için erken embriyonik pozlama etkisini incelemek için bir etkili lab modelini kullanarak bir strateji göstermek için sağlanan Sağladığımız verimlilik ve bizim yaydıkları pozlama biyo-deneyleri etkinliğini izlemek için davranışsal deneyleri.

Video: Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Gelişim Biyolojisi

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Kullanımı

Transcriptome Profil

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi