Suporte pelo NSF (EPSCoR EPS-0814251) e reconhece com gratidão-NIH (1P20GM103653-01A1) para MKT e HSD, suporte de estudante institucional da Universidade Estadual de Delaware para MDM (título III HBGI) e KRS (NIH-INBRE). Graças ao centro de genética c. elegans (suportado pelo NIH escritório de pesquisa programas de infra-estrutura P40 OD010110) para c. elegans estirpe selvagem-tipo N2.

Protocolos abaixo tem sido padronizados para testar os efeitos da exposição BPA durante a embriogênese precoce e podem ser modificados para uso com BPS, BPF ou outros CDE e substâncias tóxicas em embriões de c. elegans .
1. material instalação
<ol><li>Prepare 500 mL de mídia de18 nematódeo crescimento Media (NGM) dissolvendo-se 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona e 8,5 g de ágar-ágar em água de 500 mL. Após a esterilização em autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 min.), adicionar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M CaCl2 e 12,5 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g de K2HPO4, água para 1L).</li>
	<li>Prepare a solução de hipoclorito pela mistura de 25 mL de 1 N KOH, 4 mL de água sanitária e 71 mL de água. Tornam essa solução fresca.</li>
	<li>Prepare o M9 Buffer misturando 3 g de KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4e água a 1 L.</li>
	<li>Prepare o Buffer S18 misturando 129 mL de 0,02 M K2HPO4mL 871 de KH2PO4e 5,85 g de NaCl.</li>
	<li>Esterilize o M9 e S buffers em autoclave.</li>
	<li>Cresce uma cultura durante a noite de Escherichia coli (cepa 50 OP) em 20 mL de caldo de Luria (LB).</li>
	<li>Dissolva o BPA em 10% de etanol para fazer uma solução stock de 1 mM. Faça diluições subsequentes de 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM em buffer de S. Nota: Diluição no buffer S aquoso reduz a concentração de etanol; por exemplo, a maior concentração de BPA descrito neste protocolo (10 µM), a concentração de etanol é 0,1% v/v.</li>
</ol>2. Culturing de c. elegans e sincronização
<ol><li>Despeje a mídia NGM chapas de 100 milímetros (cerca de 25 mL/placa) e deixar solidificar. Uma vez solidificado, propagar as placas espalhando 150 µ l de Escherichia coli OP50 da cultura líquida cresceu durante a noite. Incube as placas a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, traslado N2 vermes nas chapas de novo reunir uma laje aproximada do quadrado de 1 cm. Permitir que vermes a crescer por 3 dias a 20 ° C até que a placa é preenchida com adultos maduros bem alimentados contendo embriões visíveis.</li>
	<li>Para sincronizar, lave cada placa pipetando até 5 mL de tampão de M9 através da placa. Transferi o líquido para um tubo de centrifuga conico de estéril 15 mL. Nota: A sincronização é feita para matar vermes adultos e coletar embriões que são relativamente o mesmo palco.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g, durante 4 min à temperatura ambiente, a fim de obter uma pastilha solta de vermes adultos.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de 10 mL, remova cuidadosamente o sobrenadante por forma a deixar a pelota intacta. Adicionar 5 mL da solução de hipoclorito e misture suavemente.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 x g , à temperatura ambiente durante 4 minutos.</li>
	<li>Remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL e lave com 7 mL de tampão de M9. Repita duas vezes.</li>
</ol>3. expor Worms ao BPA
<ol><li>Após a última lavagem do passo 2.7 acima, suspenda a cerca de 100 µ l de ovos com buffer M9. Transferi 50 µ l de ovos para tubos de microcentrífuga de 2 mL contendo já a concentração adequada que BPA diluído em tampão de S. Ajuste a quantidade de buffer de S para garantir a correta concentração final de BPA (µM 0.0, 0.1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM e 10 µM) pelo tubo. A tabela 1 ilustra uma maneira de tornar estas diluições.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Para a concentração Final de BPA</td>
			<td>Estoque de BPA (100 μM)</td>
			<td>S Buffer</td>
			<td>Worms sincronizado</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 ΜM</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>949 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 ΜM</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>945 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ΜM</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>940 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ΜM</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ΜM</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>ΜL DE 850</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Estoque BPA, buffer de S e vermes sincronizadas usados para atingir a concentração desejada usada para nosso estudo.
<ol start="2"><li>Coloque os tubos em uma coqueteleira e agite por 4 h a 20° C, em 25 rpm para um agitador rotativo ou 25 inclina-se. / min. para um balanço shaker.</li>
	<li>Após 4 h, coloque os tubos nos suportes de tubo e permitir worms para resolver.</li>
	<li>Descartar o sobrenadante e transferir vermes para placas semeadas (placas NGM com OP50 Escherichia coli). Fazer a cultura OP50 Escherichia coli líquida tal como afirmado no 1.5 e propagar as placas, como indicado no ponto 2.1.</li>
	<li>Deixe os vermes crescem para 60h em 20 ° C. Examine placas todos os dias para a contaminação. Placas NGM contaminadas são geralmente descoloradas e acompanhadas de colônias individuais. Verifica vermes sob o microscópio para superlotação. Falta de gramado OP50 Escherichia coli e vermes concentradas em pequenos pontos significam a superlotação.</li>
</ol>4. ensaio de habituação de toque anterior
<ol><li>Transferência de aproximadamente 10 jovens sincronizados pegar vermes adultos para novas placas não-semeadas de NGM usando um fio de platina 30 G fogo-esterilizados. Deixar vermes sem ser perturbado por 5 min permitir-lhes tempo para se aclimatar à nova placa.</li>
	<li>Para a resposta de habituação, usar um sobrancelha cabelo anexado ao fim de um espeto de madeira ou palito de dente e esterilizar mergulhando em etanol a 70%. Limpe com um tecido limpo cotão e esperar 1 min para etanol evapora-se fora. Toque suavemente o verme na cabeça (anterior do bulbo faríngeo) usando os pelos da sobrancelha. Repita os toques, permitindo que 10 s entre toques a fim de permitir que o worm recuperar.</li>
	<li>Continue a tocar (permitindo 10 intervalos de interstimulus s) até que o worm já não se move para trás. Neste ponto, o worm tem habituado ao estímulo. Registre o número de toques necessários para o worm para se habituar.</li>
	<li>Analise a diferença entre as taxas de má habituação dos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.</li>
</ol>5. worm fecundidade ensaio
<ol><li>Transferência individuais vermes L3 para um prato fresco e semeado usando uma picareta de platina. Certifique-se que apenas um verme é colocado por placa. Nota: após a fase larval de L3, vermes evoluir para a fase larval de L4 e idade adulta. Pegá-los cedo é conveniente em que eles são grandes o suficiente para a transferência de animais individuais, garantindo que eles já não tinha todos os ovos que, de outra forma, iria ser desperdiçados na contagem.</li>
	<li>Conte o número de ovos postos a cada 12-24 h. Depois de contar, transferi o verme do pai para uma nova placa. Repita até que o verme para a postura dos ovos, normalmente depois de 5 dias quando incubadas a 20 ° C. Nota: em média, um verme tipo selvagem pode colocar até 300 ovos; Portanto, transferindo o pai para uma nova placa diariamente evita a superlotação.</li>
	<li>Analise a diferença entre o número médio de ovos colocados pelos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary+to+EDC-2:+The+Endocrine+Society's+Second+Scientific+Statement+on+Endocrine-Disrupting+Chemicals.">Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals.</a> Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).</li><li>Braun, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-life+exposure+to+EDCs:+role+in+childhood+obesity+and+neurodevelopment.">Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).</li><li>Melnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+the+National+Toxicology+Program's+Report+of+the+Endocrine+Disruptors+Low-Dose+Peer+Review.">Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review.</a> Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).</li><li>Kortenkamp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+mixing+cocktails:+a+review+of+combination+effects+of+endocrine-disrupting+chemicals.">Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals.</a> Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).</li><li>Vandenberg, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormones+and+endocrine-disrupting+chemicals:+low-dose+effects+and+nonmonotonic+dose+responses.">Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses.</a> Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).</li><li>Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+bisphenol+A+released+from+sealants+and+composites:+a+review+of+the+literature.">Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature.</a> Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).</li><li>Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. 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Rev. 30, 75-95 (2009).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+neonatal+exposure+to+bisphenol-a+enhances+the+central+dopamine+d1+receptor-mediated+action+in+mice:+enhancement+of+the+methamphetamine-induced+abuse+state.">Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state.</a> Neuroscience. 117, 639-644 (2003).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+and+phthalate+endocrine+disruption+of+parental+and+social+behaviors.">Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors.</a> Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).</li><li>Patisaul, H. B., Adewale, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+environmental+endocrine+disruptors+on+reproductive+physiology+and+behavior.">Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior.</a> Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).</li><li>Lee, D., Jacobs, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+issues+in+human+studies+of+endocrine+disrupting+chemicals.">Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals.</a> Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).</li><li>Mimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germline+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+Germline+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function.</a> PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).</li><li>Rankin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+revisited:+an+updated+and+revised+description+of+the+behavioral+characteristics+of+habituation.">Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).</li><li>Hope, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C elegans: A Practical Approach. , (1999).</li><li>Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+Endocrine+Disrupting+Compounds+on+the+Development+of+Vertebrate+Neural+Network+Function+Using+Multi-electrode+Arrays.">Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2017).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).</li></ol>

Os autores declaram que eles não têm nada para divulgar.

Fases de rápido crescimento e desenvolvimento como embriogênese são particularmente vulneráveis aos efeitos prejudiciais de vários compostos endócrinos, incluindo o BPA. Nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição ao BPA ou outras substâncias tóxicas no modelo de invertebrados c. elegans , que permite a titulação conveniente de uma gama de concentrações, para avaliar seu efeito sobre a viabilidade do embrião (Figura 2) . Acompanhar experimentos comportamentais sobreviventes adultos que se desenvolvem de embriões que foram expostas a baixas doses de BPA permitem a análise do efeitos a longo prazo na função neuronal (Figura 3). A ideia central deste trabalho é fornecer protocolos detalhados para expor os embriões a várias substâncias tóxicas durante o período de embriogênese inicial no modelo de c. elegans ; a primeira janela de 4 h de seu período de desenvolvimento embrionário de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde ao período de proliferação, que é seguido por organogênese. Nesse sentido, nós fornecemos a validação dos pontos de extremidade através de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa. Enquanto a base mecanicista da ação do BPA e outros bisfenóis é o Santo Graal para que destina-se a investigação neste campo, temos não uma tentativa de oferecer uma explicação mecanicista para a ação do BPA neste artigo focado de metodologia. No entanto, gostaríamos de salientar que o modelo de c. elegans oferece um sistema ideal para dissecar ainda mais o mecanismo de ação. Por exemplo, em um futuro trabalho para decifrar os mecanismos de ação do BPA, c. elegans mutantes podem ser gerados e projectado para uma resistência aos efeitos do BPA e, assim, pavimentar o caminho para decifrar o caminho. Além disso, o nosso papel de companheiro lida com o efeito do BPA no nível de sincronia da rede neural em vertebrados, fornecendo uma outra avenida para entender a base para investigar potenciais mecanismos para efeitos tóxica19.
Na metodologia detalhada neste trabalho, algumas das etapas essenciais que devem ser executados extra cuidadosamente incluem o seguinte: escolha um prato com bem alimentados c. elegans adultos com ovos maduros visíveis sob o microscópio de dissecação é essencial, e Falha ao seguir esta etapa irá resultar em um tamanho de amostra insuficiente de embriões para o experimento Exposição EDC. Também é importante para se certificar de que a solução de hipoclorito é feita fresca para evitar a obtenção de uma população não sincronizada que irá interferir com a capacidade de realizar exposição BPA durante a embriogênese precoce. Lavagem de pelotas com M9 (após a exposição de hipoclorito) também é um passo muito importante. Se não for feito corretamente, a alta concentração de água sanitária pode resultar em embriões mortos. Além disso, os embriões devem ser transferidos para placas NGM semeadas após 4 h. Se deixada na solução de BPA por um período prolongado de tempo, os embriões são propensos a desenvolver para as larvas de dauer long-lived. Isto irá interferir significativamente com ensaio de fecundidade e ensaios comportamentais. Se qualquer uma dessas etapas é perdida, é aconselhável começar o procedimento desde o início. Se por qualquer motivo, a placa NGM com vermes está contaminada ou não tem comida suficiente, ele irá adicionar o stress sobre os vermes desse modo distorcer os dados coletados. Tais placas devem ser descartadas e não ser usadas no experimento.
Anteriormente, um notável estudo utilizado com sucesso o modelo de c. elegans para demonstrar que anomalias cromossómicas causaram pelo resultado BPA, devido a avaria da maquinaria de reparo de DNA no germline14. No entanto, é notável que o projeto de estudo acima tinha usado a exposição contínua do BPA de c. elegans a altas doses de BPA durante toda sua vida. Nossa metodologia foi projetada para estudar a baixas doses de exposição BPA durante a embriogênese precoce, a fim de ensaiar seus efeitos sobre a viabilidade embrionária e sutis efeitos de longo prazo sobre os sobreviventes. A nosso conhecimento, nenhuma metodologia foi desenvolvida para expor os embriões adiantados palco para muito baixas doses de BPA, limitado a um período especificado de tempo; assim, tornando o método apresentado aqui romance.
Além disso, os protocolos fornecidos aqui pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de outros CDE durante a fase de proliferação da embriogênese. No entanto, a fim de estudar a tarde estágios embrionários, o protocolo exigirá modificações chaves para a janela de tempo crítico de desenvolvimento sob foco. Além disso, nosso protocolo não será adequado para experimentos que exigem tempos mais longos de exposição tóxica, como abre a possibilidade da via de desenvolvimento alternativo, resultando na detenção longeva dauer no segundo ciclo muda, que é resistente para condições severas de20. Outras modificações e aperfeiçoamentos serão necessários para tempos mais longos de exposição através de suplemento com uma fonte de alimento que não tem potencial para metabolizar a toxicidade ou EDC por exemplo autoclavado Escherichia coli. Em conclusão, nossa metodologia pode ser utilizada para avaliar os efeitos de vários produtos químicos sobre a fecundidade e na função neuronal endócrinos no sistema de invertebrados modelo c. elegans.

Exposição a tóxicos ambientais, particularmente os compostos aqueles que tendem a interferir com o desenvolvimento, tem estado sob escrutínio científico cuidadoso nos últimos anos. Mais de mil produtos químicos de uso diário são classificados como endócrinos compostos (EDC)1. Períodos de rápido crescimento e desenvolvimento, que incluem embrionárias, infantil e fases de infância, eram conhecidos por ser particularmente vulneráveis aos efeitos deletérios que mesmo baixas doses EDC. Seus efeitos foram mostrados para causar reprodutivo e neurológico transtornos2. A orientações painel nos agência de proteção ambiental e nos programa nacional de toxicologia, uma dose baixa pode ser definida como qualquer dose abaixo do nível do que foi relatado para causar uma mudança biológica observável ou danificar a3. Além dos efeitos de doses baixas de CDE individuais, misturas de vários CDE encontrado em baixas concentrações no ambiente têm o potencial de causar efeitos cumulativos substantivas4.
Bisphenol A (BPA ou 4,4'-(propane-2,2-diyl)) é um agente de polimerização encontrado em itens comumente usados como garrafas de água, armazenamento de recibos, selantes dentários e os forros de bebida e comida latas5. Devido à sua semelhança estrutural com 17 β Estradiol (E2) e a sua afinidade para os receptores de estrogênio ERα e ERβ, BPA foi classificado como um produto químico (EDC)5,6endócrinos. Apesar de mais fraco, afinidade do BPA para receptores de estrogênio mostrou que afetam o sistema de reprodução de ambos os sexos e interromper funções neurais em doses que são considerados seguros7,8. Foram observadas alterações na metilação do DNA, através de mecanismos epigenetically regulamentados para causar defeitos neuronais a longo prazo em ratos expostos ao BPA9. Especificamente, o BPA também tem sido implicado como um possível culpado para o aumento das taxas de hiperatividade, deficiência de atenção e aumento da sensibilidade às drogas devido ao aumento de visto em receptores de dopamina D1 do posencéfalo límbica do rato após exposição crônica 9 , 10. evidência significativa sobre os efeitos deletérios da CDE sobre a saúde humana é baseada em estudos de correlação, concentrando-se principalmente na exposição crônica das populações a tóxicos ambientais, mesmo em doses baixas,5; no entanto, limitações em inferências de estudos humanos e na manipulação de controles experimentais foram aceites ao se lidar com as críticas de campanha publicitária sem fundamento11,12.
Devido à conservação dos genes Caenorhabditis elegans' em relação dos mamíferos, incluindo seus genes do hormônio esteroide-receptor, os pesquisadores utilizaram este modelo de laboratório geneticamente tractable para desvendar os efeitos funcionais e mecanicistas da CDE 13. experimentos com c. elegans mostraram que estes compostos tais como o BPA e BPS podem causar apoptose, mortalidade embrionária, ruptura nos mecanismos de reparação da quebra de DNA dupla-hélice e função neural14,15 ,16.
Nosso laboratório tem mostrado anteriormente que nem baixa dose exposição limitada a embriogênese precoce leva a fecundidade baixou com défices comportamentais nos sobreviventes adultos15. Habituação a um estímulo repetido é uma forma de aprendizagem não associativa em sistemas modelo, incluindo c. elegans, e nossa metodologia usa esta forma de aprendizagem não-associativa como uma saída comportamental a ensaiar os efeitos a longo prazo da exposição embrionária para as substâncias tóxicas17 especificamente, nós fornecemos protocolos detalhados para estudar a exposição BPA em c. elegans, incluindo seus efeitos imediatos sobre mortalidade embrionária e efeitos a longo prazo sobre o comportamento do adulto, com uma esquema geral retratada em Figura 1. Resultados representativos de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa são fornecidos para realçar a eficácia de nossa metodologia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25761B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7758-11--4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239658-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>103039-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 (Wild-type C. elegans) worms</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td>Repository at U of Minnesota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire pick</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-2TYY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term behavioral and reproductive consequences of embryonic exposure to low-dose toxicants

Bisfenóis, tais como o bisfenol A (BPA) e Bisfenol S (BPS) são polimerização agentes amplamente utilizados na produção de plásticos e inúmeros produtos de uso diário. Com base na sua estrutura química e propriedades biológicas como estradiol, eles foram classificados como endócrinos compostos (EDC). A exposição prolongada a CDE, mesmo em doses baixas, tem sido associada a vários defeitos de saúde, incluindo câncer, distúrbios comportamentais e infertilidade, com maior vulnerabilidade indicada durante os períodos do desenvolvimento precoce. Estudos celulares e moleculares com o geneticamente tractable modelo nemátode Caenorhabditis elegans têm demonstrado que a exposição ao BPA provoca apoptose, letalidade embrionária e perturbação no DNA mecanismos de reparação. Informamos anteriormente que a exposição dos embriões de c. elegans de baixas doses de fecundidade diminui de bisfenóis diferentes. Além disso, mostramos que os efeitos da exposição durante a fase inicial de desenvolvimento persistirem na vida adulta como analisada quantificando o comportamento de habituação, uma forma de aprendizagem não associativa. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para exposição embrionária a CDE baixa dose anterior e a fecundidade associada toque ensaios de habituação, juntamente com resultados representativos.

Estudos anteriores com c. elegans relataram que a exposição contínua a altas concentrações de BPA (≥ 1 mM) ao longo do desenvolvimento do embrião e a idade adulta diminui fecundidade14. Estudos subsequentes relatados do nosso laboratório mostraram que os embriões que foram expostos ao BPA durante um período limitado de 4h nos estágios iniciais do seu desenvolvimento mostrou uma diminuição no número de ovos viáveis definidos como adultos15 (Figura 2). Duas principais características da metodologia foram que (i) as concentrações de BPA usadas eram significativamente mais baixo (0.1 µM a intervalo de 10 µM) e (ii) a exposição foi limitada ao início do período embrionário. Além de diminuição da fecundidade, mesmo em doses mais baixas, nossos ensaios de habituação revelaram que vermes expostos ao BPA como embriões necessários mais estímulos para tornar-se hábito quando comparado aos vermes expostos ao veículo sozinho15 (Figura 3). Estes efeitos são dignos de nota, em que se baseiam na exposição BPA de baixa dose, seguindo a lógica que efeitos mais sutis na função neuronal que pode não ser morfologicamente aparente são prováveis ser discernível através de mudanças de comportamento. Em suma, os resultados representativos apresentados aqui sublinhado o fato de que os efeitos nocivos da exposição BPA para um embrião influencia seu desenvolvimento, incluindo a função neuronal que pode ser avaliada através de ensaios de comportamentais adultos em c. elegans. Protocolos fornecidos aqui podem ser usados para testar os efeitos de baixa dose, bem como a longo prazo de outros potenciais tóxicos incluindo compostos de interrupções do sistema endócrino.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do desenho experimental. Vermes adultos foram coletadas e expostas a solução de hipoclorito a fim de coletar embriões sincronizados. Os embriões foram então expostos a diferentes concentrações de BPA para 4 h. Os embriões expostos foram transferidos para placas NGM semeadas, onde eles foram autorizados a crescer para 60 h a 20 ° C. Para testar a eficácia de exposição durante os estágios iniciais de desenvolvimento, os vermes L4 foram transferidos para pratos individuais e testados para a fecundidade, e jovens adultos foram testados com toque anterior habituação. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig2.jpg"> Figura 2: fecundidade é abaixada pelo BPA. Exposição de 1 µM e maiores concentrações de BPA diminuiu significativamente o número de ovos postos em comparação ao controle (representado pela linha horizontal; n = 10, *p < 0,05). Barras de erro denotam SEM. análise feita utilizando ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56771/56771fig3.jpg"> Figura 3: efeitos a longo prazo da exposição BPA embrionária são refletidos no comportamento adulto. Os embriões expostos a concentrações de BPA tão baixas quanto 0,1 µM afeta habituação não-associativa toque anterior em adultos (n = 60, *p < 0,05). Barras de erro denotam SEM; ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 201515. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56771/56771fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.

A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K visualizações.  Johns Hopkins School of Medicine. Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.

Vídeo: Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Biologia do Desenvolvimento

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para

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Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Usando

Transcriptoma Profiling de

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Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

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