Estamos agradecidos por el apoyo financiero de los fondos Nacional de Ciencias naturales de China (31770968), Tianjin programa de investigación de Fundación de aplicación y tecnología avanzada (17JCZDJC33400).

1. fabricación de heparina incorporada la nanocobertura Starpeg
<ol><li>
Síntesis de succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina y disolver en 2,0 mL de agua desionizada helada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Mezcla el NHS y EDC soluciones en un matraz de fondo redondo. Deje la solución mezclada en el banquillo a temperatura ambiente durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de NHS de EDC a 5.031 x g por 10 min eliminar el exceso de EDC y NHS.</li>
		<li>Añadir 30 mL de etanol frío a la solución de mezcla y centrifugar a 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repetir dos veces.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la nanocobertura heparina starPEG
	<ol>
<li>Añadir 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 a un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Añadir 0,67 mL de 10% (p/v) heparina-NHS el mismo matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Coloque la solución mezclada de starPEG-(NH2)8 y heparina-NHS en una incubadora a 25 ° C por 20 min obtener una solución clara con viscosidad. Nota: Para los experimentos en que fluorescencia etiquetada heparina (heparina de FAM) fue requerida, el procedimiento de fabricación es el mismo excepto que la estrella de (NH2) - PEG -8 fue disuelto en agua desionizada con 5.6- carboxyfluorescein Nsuccinimidyl - éster 0.1% (fracción molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterización de la nanocobertura heparina-PEG por Fourier transforman espectroscopía infrarroja (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de empezar, enjuague el dispositivo de mortero, mortero y granulación de ágata (pequeños discos con diámetro de 13 mm) con acetona y agua desionizada. Seque el vidrio en un horno antes de usarlo.</li>
		<li>Mezcla aproximadamente 0.1 – 1% heparina-PEG muestra con 200 – 250 mg de polvo fino de KBr.</li>
		<li>Coloque la mezcla de KBr y heparina-PEG en el mortero de ágata y pulverizar finamente en pequeñas bolitas con un diámetro de 2 μm.</li>
		<li>Transferir la mezcla a un dispositivo de granulación. Aplique la fuerza de compresión alta (8 T/cm2) en el vacío durante 1-2 min formar bolitas transparentes.</li>
		<li>Tire suavemente de las pelotillas de la muestra respecto a la dispositivo de granulación. Tenga cuidado de no tirar demasiado para no incurrir en grietas.</li>
		<li>Transferir las pelotillas muestra muy cuidadosamente a un espectroscopio infrarrojo de Fourier transforma para determinar la estructura química de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de las estructuras internas de la porosidad de la nanocobertura heparina-PEG por escaneada la microscopia electrónica (SEM)
	<ol>
<li>Para los siguientes procedimientos, preparar pipetas y placa de cultivo de célula estándar de 48-bien.</li>
		<li>Pipetear la solución de copolímero de PEG de heparina en los pocillos de una placa de cultivo de 48-bien.</li>
		<li>Congelar la placa a-80 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Lypophilize las muestras a-50 ° C en ambiente de vacío (0.1 Pa) durante 24 h.</li>
		<li>Distribuyen las muestras en la superficie pegajosa de un trozo de aluminio.</li>
		<li>Cubrir las muestras con oro y observe bajo el microscopio electrónico escaneado para observar estructuras internas porosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG por microscopía de fuerza atómica (AFM)
	<ol>
<li>Limpiar el portaobjetos de vidrio de sílice con solución Piraña (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C durante 40 minutos.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 minutos y luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Secar los portaobjetos por secado al vacío.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con abundante 3-aminopropil trietoxisilano solución 2% de tolueno, agitar suavemente.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 min luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Coloque 100 μl de solución de heparina-PEG 3% toda la superficie de los portaobjetos con ayuda de una pipeta estándar.</li>
		<li>Examinar la superficie de heparina-PEG bajo un microscopio de fuerza atómica (una frecuencia resonante de 50 a 80 kHz, la fuerza constante de 0.350 N m 21, radio de punta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ratón islote ingeniería de superficies con heparina-PEG nanocobertura
<ol><li>
Capa superficial del islote ratón con heparina-PEG nanocobertura
	<ol>
<li>Extraer los islotes de ratón colagenasa digestión histopaque gradiente purificación y según lo divulgada previamente en JoVE19.</li>
		<li>Dedazo 200 islotes bajo un microscopio de disección a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 500 μl de PBS a los islotes y centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 250 μl de la solución de heparina-PEG y mantener la mezcla en hielo durante 10 minutos la pipeta hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes mezclar bien con la solución de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y agregar 500 μl de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugue a 503 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante y mantener los islotes para su uso posterior. Para la examinación de los islotes de ratón recubierto con heparina-PEG, FAM-heparina-PEG fue utilizado para el recubrimiento de islote siguiendo estos pasos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de los islotes de ratón con la nanocobertura FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Añadir 1-2 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% suero bovino fetal en los islotes revestidos y transferir estos islotes en una placa de cultivo bacteriano estéril no cargado.</li>
		<li>Observar las señales de morfología y de la fluorescencia de FAM-heparina-PEG revestido de la nanocobertura islotes bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. función de la heparina-PEG revestido islotes de ratón comparados con islotes sin recubrimiento
<ol><li>
Viabilidad de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG
	<ol>
<li>Dedazo de 20 de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG y colocarlos en un pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de ratón recubierto de heparina-PEG para cada pozo.</li>
		<li>Dedazo 20 de islotes de noncoated control y colocarlos en un pozo de la misma placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de noncoated de control para cada pozo.</li>
		<li>Colocar 200 μL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene islotes y mantener en cultivo durante 14 días.</li>
		<li>Sustituir los medios de cultivo de islotes pancreáticos cada 2 días.</li>
		<li>Tratar los islotes con un vivo o muertos kit de tinción en el final de 14 días en cultura y observados bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
		<li>Células en cada islote bajo un microscopio de fluorescencia invertido en cuenta PI+ (rojo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularización de la heparina-PEG cubierto de islotes de ratón in vitro
	<ol>
<li>Pre-enfriar todos los plásticos experimentales incluyendo placa de cultivo y por lo menos 12 h antes de usar puntas de pipeta.</li>
		<li>Lugar un 24-bien sobre un cojín de la refrigeración. Añadir 250 μl de hielo frío Matrigel reducido factor de crecimiento en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Coloque la placa de 24 pocillos recubierta a 4 ° C durante al menos 30 minutos.</li>
		<li>Mientras la solución de la matriz está en la nevera, trypsinize las células endoteliales de milla Sven 1 (MS1) ratón islote pancreático.<ol>
<li>Quite todos los medios de cultivo del frasco de cultivo de tejidos. Enjuague el matraz con 5 mL de PBS.</li>
			<li>Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 3 minutos en una incubadora estándar.</li>
			<li>Golpee ligeramente la parte inferior del frasco para separar las células y añadir 5 mL de medio de suplemento de suero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en el tubo y semilla de 50.000 células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubiertos de solución matriz.</li>
		<li>Añadir 5 islotes recubierto de heparina-PEG o control noncoated islotes en cada pozo.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en cada pozo a un total de 500 μl por pocillo.</li>
		<li>Observar la formación del tubo después de 4h y 24 h de incubación bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreción de insulina estimulada por glucosa de islotes recubierto de heparina-PEG Nota: Para determinar si la nanocobertura afectaría a la función de los islotes de ratón, se evaluó la secreción de insulina estimulada por glucosa de heparina-PEG revestido e islotes noncoated.<ol>
<li>Dedazo 30 recubierto de heparina-PEG islotes o islas noncoated control en un tubo de 1,5 mL. Preparar cada uno un total de 10 tubos de islotes revestidos e islotes noncoated.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución salina fisiológica con 2 mmol/L glucosa20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para la receta de la solución salina fisiológica, consulte la tabla 1. Mantenga la tapa de los tubos sueltos durante la incubación en la incubadora.</li>
		<li>Quite tanta solución como sea posible.</li>
		<li>Estimular islotes por añadir 600 μl de solución salina fisiológica complementada con 20 Glucosa mmol/L a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Recoger 200 μL del sobrenadante de cada tubo para la cuantificación de ELISA usando una insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se demuestra un enfoque "fácil-a-adoptar" para la vida de la superficie de la célula una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura de ingeniería y la grupos amino de la membrana superficial del islote pancreático. De hecho, los grupos aminos en las membranas celulares son altamente reactivos, y como resultado, estudios anteriores han reportado interacciones entre los grupos aminos primarios con activado N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster bajo condiciones fisiológicas14 ,16,21. Además, una amplia investigación ha informado que incorporación de heparina, un glucosaminoglicano altamente sulfatada y componente importante de la matriz extracelular durante la encapsulación del islote, podría conducir a poste-trasplante mejorada revascularización y reducido IBMIR22,23. Teniendo en cuenta la biocompatibilidad de PEG y multivalentes propiedades de heparina, se utilizó PEG 8-armado de heparina máxima carga durante la fabricación de la nanocobertura. La heparina fue modificada con -NHS, que posteriormente sería reaccionar con los grupos de2 -NH en membrana de la célula del islote. Activando la formación de enlace covalente entre -NH2 (de membrana de la célula) y -NHS de la clavija de Hep, los islotes serían fácilmente "cubrir" la clavija incorporada de heparina, formando así una capa delgada de nano (nanocobertura) en la superficie externa de la pancreática islotes.
El enfoque actual es diferente de métodos previamente publicados que también seleccionaron PEG como el polímero importante para microencapsulación de islote en eso química de pseudo-bioorthogonal entre los -NHS (de la nanocobertura) y -NH2 de la célula del islote membrana fue utilizada. Teniendo en cuenta que la estabilidad de la célula del islote capa, especialmente en un entorno complejo como el plasma, es crucial para la revascularización posterior al trasplante y la supervivencia, la formación entre el NHS - y -NH2 sería más estable en comparación con interacción hidrófoba entre PEG y membrana celular24, interacciones electrostáticas9,15,24,25,26 o vínculo biológico entre la biotina estreptavidina14.
Además, en contraste con islote enfoque de capa que se basa en el enfoque de la LBL con período de manejo extendido islote de deposición multicapa14,16,25, la presente técnica también requiere un mínimo procesamiento y muy corto período de la capa de los islotes aislados. Ambos de estos factores son esenciales para la supervivencia después del trasplante del islote ya que viabilidad de islotes a menudo ya está comprometido aislamiento islote siguiente debido a la ECM dañado durante la digestión enzimática. Sin embargo, una limitación del enfoque actual es que, a diferencia de LBL, que espesor de la capa externa puede ser controlado por aumentar o reducir el número de la deposición de la capa, espesor de la nanocobertura Hep-PEG no puede ser adaptado por el momento.
Además, debido a la condición suave donde la reacción química entre el NHS - y -NH2 se lleva a cabo, el actual enfoque es aplicable para la célula viva superficie ingeniería no se limita a islotes pancreáticos, pero la mayoría la terapia celular. Además, teniendo en cuenta que la heparina es conocida para interactuar con una variedad de citoquinas y moléculas biológicamente activas, la nanocobertura Hep-PEG también presenta una plataforma abierta que tiene el potencial para la incorporación de mediadores biológicos ilimitados así como interfaces para la ingeniería de superficies de células más compleja.

La eficacia terapéutica de las terapias basadas en células está limitada por células baja retención y supervivencia pobre1,2. Con el fin de mejorar el resultado de terapias con células madre, ingeniería de superficies a través de la manipulación enzimática de la célula, péptido Conjugación, bioorthogonal química y física encapsulación con biomateriales ha sido explotados3,4, 5,6,7,8,9,10. El protocolo actual pretende lograr ingeniería de superficies de las células vivas utilizando un método "fácil-a-adoptar" aplicando una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (heparina-PEG) a la superficie de la célula. Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos fue presentado aquí como un ejemplo debido a la naturaleza heterogénea de los islotes de Langerhans y los resultados despectivos del trasplante clínico de islotes actual.
De hecho, el trasplante clínico de islotes se realiza actualmente por inyección directa de islotes aislados en la vena porta hepática y este procedimiento sólo está disponible para pacientes selectivos debido a la escasez de donantes materiales y baja eficacia terapéutica 11. convencionalmente, alginato ha sido el biomaterial más comúnmente utilizado para la encapsulación de islote y modificación superficial, aunque es menos que ideal debido a la inestabilidad química de alginato y fibrosis inflamatoria relacionada con12, 13. Además, en comparación con el tamaño natural de islotes que oscila entre 100 a 200 μm, las microcápsulas de alginato-islote son más grandes, que oscilan entre los 400 y 800 μm, que exceda la distancia de difusión fisiológica de oxígeno. Encapsulación de islote conformal, es decir., encapsulando islotes sin alteración significativa del volumen del islote, fue entonces desarrollado. Así, la deposición de nanomembranes compuesto por PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicio o nanocobertura varias capas (también conocido como la técnica de la "capa por capa" [LBL]) ha sido reportada, dando por resultado mejorado en vitro la supervivencia de la isla14 ,15,16,17,18, aunque la LBL enfoque a menudo requiere extensos islotes dando período de deposición de capas múltiples, que puede comprometer la viabilidad del islote . Por otra parte, la inestabilidad de nanomembranes que se basa en las interacciones electrostáticas o covalentes entre capas de biomembrana o interacciones hidrofóbicas entre nanomembranes y la superficie del islote también plantea preocupaciones9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Otro factor limitante que afecte el resultado terapéutico del trasplante intraportal islote es la instantánea sangre mediada por reacción inflamatoria (IBMIR) causada por el contacto directo de implantado islotes de sangre, resultando en la agregación plaquetaria, coagulación y efecto inmune adversa o indeseable activación celular9. Para abordar estos problemas, una nanocobertura ultra fina compuesta de glicol de polietileno en forma de estrella (starPEG) fue preparada por su biocompatibilidad establecido y su versatilidad como material de la cubierta del islote. Heparina, un glicosaminoglicano altamente sulfatado, se incorporó en la nanocobertura starPEG por sus propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y capacidad para facilitar la vascularización mediante la contratación de pro-angiogenic Factores del crecimiento22, 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Ingeniería de superficies de la célula puede proteger las células implantadas del ataque inmune del anfitrión. También puede cambiar la forma de paisaje celular para mejorar la función del injerto y supervivencia después del trasplante. Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (Hep-PEG). Para generar la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islote pancreático, succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS) primero fue sintetizado por la modificación de sus grupos carboxilato con N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etilo carbodiimida clorhidrato (EDC) y N- hydroxysuccinimide (NHS). La mezcla Hep-PEG fue formada entonces por reticulación del amino final funcionalizados ocho brazos starPEG ((NH2) de starPEG-8) y heparina-NHS. Para la capa superficial de la isla, islotes de ratón fueron aislados mediante colagenasa digestión y la purificación del gradiente usando Histopaque. Islotes aislados fueron tratados luego con solución de PEG Hep fría hielo por 10 min permitir la unión covalente entre el NHS y los grupos amino de la membrana de la célula del islote. La nanocobertura con Hep-PEG incurre la alteración mínima del tamaño del islote y volumen y heparinización de los islotes con Hep-PEG también pueden reducir la reacción inflamatoria mediada por sangre instantánea durante el trasplante de islotes pancreáticos. Este enfoque de "fácil-a-adoptar" es lo suficientemente suave para la ingeniería de superficie de células vivas sin comprometer la viabilidad celular. Teniendo en cuenta que la heparina ha demostrado afinidad de unión a múltiples citoquinas, la nanocobertura Hep-PEG también proporciona una plataforma abierta que permite la incorporación de mediadores biológicos funcionales ilimitadas y superficies multicapas para vivir superficie de la célula Bioingeniería.

La nanocobertura heparina-PEG fue sintetizada por la conjugación de heparina con EDC y NHS como acoplamiento agentes (figura 1) y starPEG-(NH2)8 . Estructura química de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por FT-IR y como se muestra en la figura 2, se pudieran observar picos característicos de la heparina en 3.300-3.600 cm-1, correspondiente a los grupos del oxhidrilo de la heparina (figura 2 rojo). La disminución en la amplitud del pico en 3.300-3.600 cm-1 (figura 2 azul) representa la conjugación entre el starPEG (NH2)8 amida grupos y el grupo carbonilo de la heparina. Amplitud de pico 1.650 cm-1 corresponde a la amida carbonilo que se extiende la vibración también se redujeron, indicando suficiente reacción entre los grupos carboxilatos de la heparina con succinato de succinimidyl y amina de starPEG-(NH2) 8. estructura de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por microscopia de fuerza atómica y aparece de Lou et al., la nanocobertura fue aproximadamente 30 nm de altura y 2 μm de ancho con pequeñas características porosas (manchas oscuras) que van entre 100 y 200 nm de diámetro10. Datos obtenidos de microscopía electrónica escaneada también confirman la estructura porosa altamente interconectada de la heparina-PEG (figura 3), sugiriendo que podría ser conveniente para la supervivencia de la célula durante el parto en vivo.
Revestimiento de la superficie de los islotes de ratón aislados fue examinado y como se presenta en la figura 4, capa delgada de la nanocobertura, demostrada por fluorescencia verde fue depositada uniformemente toda la superficie de recubrimientos islotes sin causar cambios evidentes en el islote volumen/tamaño. Durante el recubrimiento, es aconsejable mantener los islotes de hielo para mantener su viabilidad. Del mismo modo, el período de la capa, 10 minutos en este caso, fue también optimizada para permitir el mantenimiento de la viabilidad de los islotes. Cabe destacar que para la mejor observación de la nanocobertura, la microscopia electrónica que examina las secciones de islotes revestidos como previamente divulgados9,16 sería más apropiada, aunque los datos se generarían de islotes fijos y embedded en lugar de estar islotes en cultivo.
En cuanto a supervivencia y función de islotes revestidos, revascularización de islote y funciones en han sido evaluadas in vitro. Teniendo en cuenta las propiedades beneficiosas de la heparina, funcionalización de la heparina sobre la superficie del islote podría facilitar la revascularización islote en la cultura y por lo tanto su supervivencia. Hemos observado que los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad robusto islotes en cultivo (figura 5). Significativamente más avanzada formación vascular era también evidente a partir de células endoteliales del islote (MS1) que fueron cultivadas conjuntamente con heparina-PEG revestido islotes, indicados por estructuras alargadas en microvasos y red-como las estructuras vasculares (figura 6 ).
El proceso de la nanocobertura no incurridos capacidad secretora de efecto insulina estimulada por glucosa de los islotes de recubierto de heparina-PEG. Bajo nivel de secreción de insulina se observó en todos los grupos de tratamiento cuando islotes fueron perfundidos con solución salina fisiológica con sub-stimulatory nivel de la glucosa (2 mmol/L; Figura 7). Cuando islotes fueron estimulados con un nivel supra fisiológico de la glucosa (glucosa de 20 mmol/L), se observó aumento en la secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estructura química de la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islotes pancreáticos. Capa del islote fue alcanzada por reticulación covalente entre la heparina-NHS y aminas primarias dentro de la membrana de la célula y estrellas - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina posee varios grupos carboxilo, que fueron modificados para tener un grupo NHS cada. Los grupos carboxilo activado de NHS reaccionará con aminas primarias de la proteína a vínculos de amida de la forma, través del cual se estabiliza la nanocobertura de Hep-PEG e islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infrarrojo de la estrella - PEG-(NH2)8, heparina y la nanocobertura Hep-PEG en seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de Hep-PEG en estado seco escaneadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Cubierto de imágenes representativas de heparina-PEG islotes bajo microscopio de fluorescencia. La heparina fue etiquetada con FAM (mostrado en verde). Las imágenes son representante de 100 islotes. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Islotes recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad islote robusto. (A) los datos presentados como mean± error de estándar del medio, n = 50 islotes por grupo. (B) las células vivas se muestran en las células verdes y muertas en rojo. Barra de escala = 100 μm. las imágenes son representativas de 50 islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocobertura facilita la revascularización intra-islote. Formación de tubo de Matrigel de MS1 células cultivadas conjuntamente con heparina-PEG cubierto de islotes y control noncoated islotes. Imágenes fueron tomadas en el bar de escala 4 y 24 h. = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocobertura no incurre ningún cambio en la función de secreción de insulina islote. Heparina-PEG islotes revestidos y control noncoated islotes (30 cada uno) fueron expuestos a 2 mmol/L (barra blanca) o 20 Glucosa mmol/L (barra negra) durante 30 minutos la secreción de insulina en respuesta a Glucosa mmol/L 20 fue comparable entre el recubrimiento e islotes. Datos se muestran como media ± error estándar de los medios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K vistas.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Investigación

Bioingeniería

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Síntesis de nanofibras a base de Queratina de Ingeniería Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Tratamiento de las estructuras de ligamentos con suero acondicionado con ejercicio: Un modelo de ingeniería de tejidos traslacional

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...