Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Estamos agradecidos por el apoyo financiero de los fondos Nacional de Ciencias naturales de China (31770968), Tianjin programa de investigación de Fundación de aplicación y tecnología avanzada (17JCZDJC33400).

1. fabricación de heparina incorporada la nanocobertura Starpeg
<ol><li>
Síntesis de succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina y disolver en 2,0 mL de agua desionizada helada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Mezcla el NHS y EDC soluciones en un matraz de fondo redondo. Deje la solución mezclada en el banquillo a temperatura ambiente durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de NHS de EDC a 5.031 x g por 10 min eliminar el exceso de EDC y NHS.</li>
		<li>Añadir 30 mL de etanol frío a la solución de mezcla y centrifugar a 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repetir dos veces.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la nanocobertura heparina starPEG
	<ol>
<li>Añadir 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 a un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Añadir 0,67 mL de 10% (p/v) heparina-NHS el mismo matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Coloque la solución mezclada de starPEG-(NH2)8 y heparina-NHS en una incubadora a 25 ° C por 20 min obtener una solución clara con viscosidad. Nota: Para los experimentos en que fluorescencia etiquetada heparina (heparina de FAM) fue requerida, el procedimiento de fabricación es el mismo excepto que la estrella de (NH2) - PEG -8 fue disuelto en agua desionizada con 5.6- carboxyfluorescein Nsuccinimidyl - éster 0.1% (fracción molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterización de la nanocobertura heparina-PEG por Fourier transforman espectroscopía infrarroja (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de empezar, enjuague el dispositivo de mortero, mortero y granulación de ágata (pequeños discos con diámetro de 13 mm) con acetona y agua desionizada. Seque el vidrio en un horno antes de usarlo.</li>
		<li>Mezcla aproximadamente 0.1 – 1% heparina-PEG muestra con 200 – 250 mg de polvo fino de KBr.</li>
		<li>Coloque la mezcla de KBr y heparina-PEG en el mortero de ágata y pulverizar finamente en pequeñas bolitas con un diámetro de 2 μm.</li>
		<li>Transferir la mezcla a un dispositivo de granulación. Aplique la fuerza de compresión alta (8 T/cm2) en el vacío durante 1-2 min formar bolitas transparentes.</li>
		<li>Tire suavemente de las pelotillas de la muestra respecto a la dispositivo de granulación. Tenga cuidado de no tirar demasiado para no incurrir en grietas.</li>
		<li>Transferir las pelotillas muestra muy cuidadosamente a un espectroscopio infrarrojo de Fourier transforma para determinar la estructura química de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de las estructuras internas de la porosidad de la nanocobertura heparina-PEG por escaneada la microscopia electrónica (SEM)
	<ol>
<li>Para los siguientes procedimientos, preparar pipetas y placa de cultivo de célula estándar de 48-bien.</li>
		<li>Pipetear la solución de copolímero de PEG de heparina en los pocillos de una placa de cultivo de 48-bien.</li>
		<li>Congelar la placa a-80 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Lypophilize las muestras a-50 ° C en ambiente de vacío (0.1 Pa) durante 24 h.</li>
		<li>Distribuyen las muestras en la superficie pegajosa de un trozo de aluminio.</li>
		<li>Cubrir las muestras con oro y observe bajo el microscopio electrónico escaneado para observar estructuras internas porosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG por microscopía de fuerza atómica (AFM)
	<ol>
<li>Limpiar el portaobjetos de vidrio de sílice con solución Piraña (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C durante 40 minutos.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 minutos y luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Secar los portaobjetos por secado al vacío.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con abundante 3-aminopropil trietoxisilano solución 2% de tolueno, agitar suavemente.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 min luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Coloque 100 μl de solución de heparina-PEG 3% toda la superficie de los portaobjetos con ayuda de una pipeta estándar.</li>
		<li>Examinar la superficie de heparina-PEG bajo un microscopio de fuerza atómica (una frecuencia resonante de 50 a 80 kHz, la fuerza constante de 0.350 N m 21, radio de punta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ratón islote ingeniería de superficies con heparina-PEG nanocobertura
<ol><li>
Capa superficial del islote ratón con heparina-PEG nanocobertura
	<ol>
<li>Extraer los islotes de ratón colagenasa digestión histopaque gradiente purificación y según lo divulgada previamente en JoVE19.</li>
		<li>Dedazo 200 islotes bajo un microscopio de disección a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 500 μl de PBS a los islotes y centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 250 μl de la solución de heparina-PEG y mantener la mezcla en hielo durante 10 minutos la pipeta hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes mezclar bien con la solución de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y agregar 500 μl de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugue a 503 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante y mantener los islotes para su uso posterior. Para la examinación de los islotes de ratón recubierto con heparina-PEG, FAM-heparina-PEG fue utilizado para el recubrimiento de islote siguiendo estos pasos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de los islotes de ratón con la nanocobertura FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Añadir 1-2 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% suero bovino fetal en los islotes revestidos y transferir estos islotes en una placa de cultivo bacteriano estéril no cargado.</li>
		<li>Observar las señales de morfología y de la fluorescencia de FAM-heparina-PEG revestido de la nanocobertura islotes bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. función de la heparina-PEG revestido islotes de ratón comparados con islotes sin recubrimiento
<ol><li>
Viabilidad de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG
	<ol>
<li>Dedazo de 20 de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG y colocarlos en un pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de ratón recubierto de heparina-PEG para cada pozo.</li>
		<li>Dedazo 20 de islotes de noncoated control y colocarlos en un pozo de la misma placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de noncoated de control para cada pozo.</li>
		<li>Colocar 200 μL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene islotes y mantener en cultivo durante 14 días.</li>
		<li>Sustituir los medios de cultivo de islotes pancreáticos cada 2 días.</li>
		<li>Tratar los islotes con un vivo o muertos kit de tinción en el final de 14 días en cultura y observados bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
		<li>Células en cada islote bajo un microscopio de fluorescencia invertido en cuenta PI+ (rojo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularización de la heparina-PEG cubierto de islotes de ratón in vitro
	<ol>
<li>Pre-enfriar todos los plásticos experimentales incluyendo placa de cultivo y por lo menos 12 h antes de usar puntas de pipeta.</li>
		<li>Lugar un 24-bien sobre un cojín de la refrigeración. Añadir 250 μl de hielo frío Matrigel reducido factor de crecimiento en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Coloque la placa de 24 pocillos recubierta a 4 ° C durante al menos 30 minutos.</li>
		<li>Mientras la solución de la matriz está en la nevera, trypsinize las células endoteliales de milla Sven 1 (MS1) ratón islote pancreático.<ol>
<li>Quite todos los medios de cultivo del frasco de cultivo de tejidos. Enjuague el matraz con 5 mL de PBS.</li>
			<li>Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 3 minutos en una incubadora estándar.</li>
			<li>Golpee ligeramente la parte inferior del frasco para separar las células y añadir 5 mL de medio de suplemento de suero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en el tubo y semilla de 50.000 células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubiertos de solución matriz.</li>
		<li>Añadir 5 islotes recubierto de heparina-PEG o control noncoated islotes en cada pozo.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en cada pozo a un total de 500 μl por pocillo.</li>
		<li>Observar la formación del tubo después de 4h y 24 h de incubación bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreción de insulina estimulada por glucosa de islotes recubierto de heparina-PEG Nota: Para determinar si la nanocobertura afectaría a la función de los islotes de ratón, se evaluó la secreción de insulina estimulada por glucosa de heparina-PEG revestido e islotes noncoated.<ol>
<li>Dedazo 30 recubierto de heparina-PEG islotes o islas noncoated control en un tubo de 1,5 mL. Preparar cada uno un total de 10 tubos de islotes revestidos e islotes noncoated.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución salina fisiológica con 2 mmol/L glucosa20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para la receta de la solución salina fisiológica, consulte la tabla 1. Mantenga la tapa de los tubos sueltos durante la incubación en la incubadora.</li>
		<li>Quite tanta solución como sea posible.</li>
		<li>Estimular islotes por añadir 600 μl de solución salina fisiológica complementada con 20 Glucosa mmol/L a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Recoger 200 μL del sobrenadante de cada tubo para la cuantificación de ELISA usando una insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se demuestra un enfoque "fácil-a-adoptar" para la vida de la superficie de la célula una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura de ingeniería y la grupos amino de la membrana superficial del islote pancreático. De hecho, los grupos aminos en las membranas celulares son altamente reactivos, y como resultado, estudios anteriores han reportado interacciones entre los grupos aminos primarios con activado N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster bajo condiciones fisiológicas14 ,16,21. Además, una amplia investigación ha informado que incorporación de heparina, un glucosaminoglicano altamente sulfatada y componente importante de la matriz extracelular durante la encapsulación del islote, podría conducir a poste-trasplante mejorada revascularización y reducido IBMIR22,23. Teniendo en cuenta la biocompatibilidad de PEG y multivalentes propiedades de heparina, se utilizó PEG 8-armado de heparina máxima carga durante la fabricación de la nanocobertura. La heparina fue modificada con -NHS, que posteriormente sería reaccionar con los grupos de2 -NH en membrana de la célula del islote. Activando la formación de enlace covalente entre -NH2 (de membrana de la célula) y -NHS de la clavija de Hep, los islotes serían fácilmente "cubrir" la clavija incorporada de heparina, formando así una capa delgada de nano (nanocobertura) en la superficie externa de la pancreática islotes.
El enfoque actual es diferente de métodos previamente publicados que también seleccionaron PEG como el polímero importante para microencapsulación de islote en eso química de pseudo-bioorthogonal entre los -NHS (de la nanocobertura) y -NH2 de la célula del islote membrana fue utilizada. Teniendo en cuenta que la estabilidad de la célula del islote capa, especialmente en un entorno complejo como el plasma, es crucial para la revascularización posterior al trasplante y la supervivencia, la formación entre el NHS - y -NH2 sería más estable en comparación con interacción hidrófoba entre PEG y membrana celular24, interacciones electrostáticas9,15,24,25,26 o vínculo biológico entre la biotina estreptavidina14.
Además, en contraste con islote enfoque de capa que se basa en el enfoque de la LBL con período de manejo extendido islote de deposición multicapa14,16,25, la presente técnica también requiere un mínimo procesamiento y muy corto período de la capa de los islotes aislados. Ambos de estos factores son esenciales para la supervivencia después del trasplante del islote ya que viabilidad de islotes a menudo ya está comprometido aislamiento islote siguiente debido a la ECM dañado durante la digestión enzimática. Sin embargo, una limitación del enfoque actual es que, a diferencia de LBL, que espesor de la capa externa puede ser controlado por aumentar o reducir el número de la deposición de la capa, espesor de la nanocobertura Hep-PEG no puede ser adaptado por el momento.
Además, debido a la condición suave donde la reacción química entre el NHS - y -NH2 se lleva a cabo, el actual enfoque es aplicable para la célula viva superficie ingeniería no se limita a islotes pancreáticos, pero la mayoría la terapia celular. Además, teniendo en cuenta que la heparina es conocida para interactuar con una variedad de citoquinas y moléculas biológicamente activas, la nanocobertura Hep-PEG también presenta una plataforma abierta que tiene el potencial para la incorporación de mediadores biológicos ilimitados así como interfaces para la ingeniería de superficies de células más compleja.

La eficacia terapéutica de las terapias basadas en células está limitada por células baja retención y supervivencia pobre1,2. Con el fin de mejorar el resultado de terapias con células madre, ingeniería de superficies a través de la manipulación enzimática de la célula, péptido Conjugación, bioorthogonal química y física encapsulación con biomateriales ha sido explotados3,4, 5,6,7,8,9,10. El protocolo actual pretende lograr ingeniería de superficies de las células vivas utilizando un método "fácil-a-adoptar" aplicando una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (heparina-PEG) a la superficie de la célula. Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos fue presentado aquí como un ejemplo debido a la naturaleza heterogénea de los islotes de Langerhans y los resultados despectivos del trasplante clínico de islotes actual.
De hecho, el trasplante clínico de islotes se realiza actualmente por inyección directa de islotes aislados en la vena porta hepática y este procedimiento sólo está disponible para pacientes selectivos debido a la escasez de donantes materiales y baja eficacia terapéutica 11. convencionalmente, alginato ha sido el biomaterial más comúnmente utilizado para la encapsulación de islote y modificación superficial, aunque es menos que ideal debido a la inestabilidad química de alginato y fibrosis inflamatoria relacionada con12, 13. Además, en comparación con el tamaño natural de islotes que oscila entre 100 a 200 μm, las microcápsulas de alginato-islote son más grandes, que oscilan entre los 400 y 800 μm, que exceda la distancia de difusión fisiológica de oxígeno. Encapsulación de islote conformal, es decir., encapsulando islotes sin alteración significativa del volumen del islote, fue entonces desarrollado. Así, la deposición de nanomembranes compuesto por PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicio o nanocobertura varias capas (también conocido como la técnica de la "capa por capa" [LBL]) ha sido reportada, dando por resultado mejorado en vitro la supervivencia de la isla14 ,15,16,17,18, aunque la LBL enfoque a menudo requiere extensos islotes dando período de deposición de capas múltiples, que puede comprometer la viabilidad del islote . Por otra parte, la inestabilidad de nanomembranes que se basa en las interacciones electrostáticas o covalentes entre capas de biomembrana o interacciones hidrofóbicas entre nanomembranes y la superficie del islote también plantea preocupaciones9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Otro factor limitante que afecte el resultado terapéutico del trasplante intraportal islote es la instantánea sangre mediada por reacción inflamatoria (IBMIR) causada por el contacto directo de implantado islotes de sangre, resultando en la agregación plaquetaria, coagulación y efecto inmune adversa o indeseable activación celular9. Para abordar estos problemas, una nanocobertura ultra fina compuesta de glicol de polietileno en forma de estrella (starPEG) fue preparada por su biocompatibilidad establecido y su versatilidad como material de la cubierta del islote. Heparina, un glicosaminoglicano altamente sulfatado, se incorporó en la nanocobertura starPEG por sus propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y capacidad para facilitar la vascularización mediante la contratación de pro-angiogenic Factores del crecimiento22, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Ingeniería de superficies de la célula puede proteger las células implantadas del ataque inmune del anfitrión. También puede cambiar la forma de paisaje celular para mejorar la función del injerto y supervivencia después del trasplante. Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (Hep-PEG). Para generar la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islote pancreático, succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS) primero fue sintetizado por la modificación de sus grupos carboxilato con N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etilo carbodiimida clorhidrato (EDC) y N- hydroxysuccinimide (NHS). La mezcla Hep-PEG fue formada entonces por reticulación del amino final funcionalizados ocho brazos starPEG ((NH2) de starPEG-8) y heparina-NHS. Para la capa superficial de la isla, islotes de ratón fueron aislados mediante colagenasa digestión y la purificación del gradiente usando Histopaque. Islotes aislados fueron tratados luego con solución de PEG Hep fría hielo por 10 min permitir la unión covalente entre el NHS y los grupos amino de la membrana de la célula del islote. La nanocobertura con Hep-PEG incurre la alteración mínima del tamaño del islote y volumen y heparinización de los islotes con Hep-PEG también pueden reducir la reacción inflamatoria mediada por sangre instantánea durante el trasplante de islotes pancreáticos. Este enfoque de "fácil-a-adoptar" es lo suficientemente suave para la ingeniería de superficie de células vivas sin comprometer la viabilidad celular. Teniendo en cuenta que la heparina ha demostrado afinidad de unión a múltiples citoquinas, la nanocobertura Hep-PEG también proporciona una plataforma abierta que permite la incorporación de mediadores biológicos funcionales ilimitadas y superficies multicapas para vivir superficie de la célula Bioingeniería.

La nanocobertura heparina-PEG fue sintetizada por la conjugación de heparina con EDC y NHS como acoplamiento agentes (figura 1) y starPEG-(NH2)8 . Estructura química de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por FT-IR y como se muestra en la figura 2, se pudieran observar picos característicos de la heparina en 3.300-3.600 cm-1, correspondiente a los grupos del oxhidrilo de la heparina (figura 2 rojo). La disminución en la amplitud del pico en 3.300-3.600 cm-1 (figura 2 azul) representa la conjugación entre el starPEG (NH2)8 amida grupos y el grupo carbonilo de la heparina. Amplitud de pico 1.650 cm-1 corresponde a la amida carbonilo que se extiende la vibración también se redujeron, indicando suficiente reacción entre los grupos carboxilatos de la heparina con succinato de succinimidyl y amina de starPEG-(NH2) 8. estructura de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por microscopia de fuerza atómica y aparece de Lou et al., la nanocobertura fue aproximadamente 30 nm de altura y 2 μm de ancho con pequeñas características porosas (manchas oscuras) que van entre 100 y 200 nm de diámetro10. Datos obtenidos de microscopía electrónica escaneada también confirman la estructura porosa altamente interconectada de la heparina-PEG (figura 3), sugiriendo que podría ser conveniente para la supervivencia de la célula durante el parto en vivo.
Revestimiento de la superficie de los islotes de ratón aislados fue examinado y como se presenta en la figura 4, capa delgada de la nanocobertura, demostrada por fluorescencia verde fue depositada uniformemente toda la superficie de recubrimientos islotes sin causar cambios evidentes en el islote volumen/tamaño. Durante el recubrimiento, es aconsejable mantener los islotes de hielo para mantener su viabilidad. Del mismo modo, el período de la capa, 10 minutos en este caso, fue también optimizada para permitir el mantenimiento de la viabilidad de los islotes. Cabe destacar que para la mejor observación de la nanocobertura, la microscopia electrónica que examina las secciones de islotes revestidos como previamente divulgados9,16 sería más apropiada, aunque los datos se generarían de islotes fijos y embedded en lugar de estar islotes en cultivo.
En cuanto a supervivencia y función de islotes revestidos, revascularización de islote y funciones en han sido evaluadas in vitro. Teniendo en cuenta las propiedades beneficiosas de la heparina, funcionalización de la heparina sobre la superficie del islote podría facilitar la revascularización islote en la cultura y por lo tanto su supervivencia. Hemos observado que los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad robusto islotes en cultivo (figura 5). Significativamente más avanzada formación vascular era también evidente a partir de células endoteliales del islote (MS1) que fueron cultivadas conjuntamente con heparina-PEG revestido islotes, indicados por estructuras alargadas en microvasos y red-como las estructuras vasculares (figura 6 ).
El proceso de la nanocobertura no incurridos capacidad secretora de efecto insulina estimulada por glucosa de los islotes de recubierto de heparina-PEG. Bajo nivel de secreción de insulina se observó en todos los grupos de tratamiento cuando islotes fueron perfundidos con solución salina fisiológica con sub-stimulatory nivel de la glucosa (2 mmol/L; Figura 7). Cuando islotes fueron estimulados con un nivel supra fisiológico de la glucosa (glucosa de 20 mmol/L), se observó aumento en la secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estructura química de la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islotes pancreáticos. Capa del islote fue alcanzada por reticulación covalente entre la heparina-NHS y aminas primarias dentro de la membrana de la célula y estrellas - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina posee varios grupos carboxilo, que fueron modificados para tener un grupo NHS cada. Los grupos carboxilo activado de NHS reaccionará con aminas primarias de la proteína a vínculos de amida de la forma, través del cual se estabiliza la nanocobertura de Hep-PEG e islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infrarrojo de la estrella - PEG-(NH2)8, heparina y la nanocobertura Hep-PEG en seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de Hep-PEG en estado seco escaneadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Cubierto de imágenes representativas de heparina-PEG islotes bajo microscopio de fluorescencia. La heparina fue etiquetada con FAM (mostrado en verde). Las imágenes son representante de 100 islotes. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Islotes recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad islote robusto. (A) los datos presentados como mean± error de estándar del medio, n = 50 islotes por grupo. (B) las células vivas se muestran en las células verdes y muertas en rojo. Barra de escala = 100 μm. las imágenes son representativas de 50 islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocobertura facilita la revascularización intra-islote. Formación de tubo de Matrigel de MS1 células cultivadas conjuntamente con heparina-PEG cubierto de islotes y control noncoated islotes. Imágenes fueron tomadas en el bar de escala 4 y 24 h. = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocobertura no incurre ningún cambio en la función de secreción de insulina islote. Heparina-PEG islotes revestidos y control noncoated islotes (30 cada uno) fueron expuestos a 2 mmol/L (barra blanca) o 20 Glucosa mmol/L (barra negra) durante 30 minutos la secreción de insulina en respuesta a Glucosa mmol/L 20 fue comparable entre el recubrimiento e islotes. Datos se muestran como media ± error estándar de los medios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K vistas.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolos de tinción de islotes pancreáticos humanos

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Investigación

Medicina

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioingeniería

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Inmunología e Infección

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biología

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

Tratamiento de islotes pancreáticos aislados y medición de la apoptosis

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...