Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Agradecemos o apoio financeiro do fundos nacionais de ciências naturais da China (31770968) e a Tianjin pesquisa programa de Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabricação de heparina-incorporada Starpeg nanocápsula
<ol><li>
Síntese de succinato de grufo de heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina e dissolver em 2,0 mL de água destilada gelada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Misture as soluções NHS e EDC num balão de fundo redondo. Deixe a solução mista no banco na temperatura ambiente por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugue a mistura de EDC NHS no 5.031 x g durante 10 minutos remover o excesso de EDC e NHS.</li>
		<li>Adicione 30 mL de álcool etílico frio para a mistura solução e centrifugar 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repita duas vezes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de nanocápsula starPEG-heparina
	<ol>
<li>Adicione 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 para um balão de fundo redondo.</li>
		<li>Adicione 0,67 mL de heparina de 10% (p/v)-NHS no mesmo balão de fundo redondo.</li>
		<li>Coloque a solução mista de starPEG-(NH2)8 e heparina-NHS na incubadora a 25 ° C por 20 min obter uma solução clara com viscosidade. Nota: Para experimentos em que se exigia fluorescente etiquetada heparina (FAM-heparina), o processo de fabricação é o mesmo exceto que a estrela de (NH2) - PEG -8 foi dissolvido em água desionizada, suplementada com 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidil éster 0.1% (razão molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização de heparina-PEG nanocápsula por Fourier Transform espectroscopia no infravermelho (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de começar, lave o dispositivo de almofariz, pilão e granulação de ágata (pequenos discos com diâmetro de 13 mm) com acetona e água deionizada. Seque o vidro em um forno antes do uso.</li>
		<li>Amostra de heparina-PEG Mix aproximadamente 0,1 – 1% com 200 – 250 mg de pó fino de KBr.</li>
		<li>Coloque a mistura de KBr e heparina-PEG o almofariz de ágata e pulverizar finamente em pequenas pelotas com diâmetros de 2 µm.</li>
		<li>Transfira a mistura para um dispositivo de granulação. Aplica força de compressão elevada (8 T/cm2) em um vácuo por 1 – 2 min formar pelotas transparentes.</li>
		<li>Puxe gentilmente as pelotas de amostra longe o dispositivo de granulação. Tenha cuidado para não puxar demais para não se incorrer em rachaduras.</li>
		<li>Transferi as pelotas de amostra com muito cuidado para um Fourier Transform Infrared espectroscópio para determinar a estrutura química de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das estruturas internas porosas de heparina-PEG nanocápsula por microscopia eletrônica de varredura (SEM)
	<ol>
<li>Para os procedimentos a seguir, prepare-se pipetas e placa de cultura de células de 48-bem padrão.</li>
		<li>Pipete a solução de copolímero de heparina-PEG para os poços de uma placa de cultura de 48-bem.</li>
		<li>Congele a placa a-80 ° C por 24 h.</li>
		<li>Lypophilize as amostras a-50 ° C, em ambiente de vácuo (0,1 Pa) por 24 h.</li>
		<li>Espalhe as amostras através da superfície pegajosa de um esboço de alumínio.</li>
		<li>Revestir as amostras com ouro e observar sob o microscópio de elétron digitalizado para observar estruturas porosas internas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame da superfície de nanocápsula de heparina-PEG por microscopia de força atômica (AFM)
	<ol>
<li>Limpar as lâminas de vidro de sílica com solução de piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C por 40 min.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10min e depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Seca as lâminas por secagem a vácuo.</li>
		<li>Lave os slides com abundância solução 3-aminopropil-triethoxysilane (2% em tolueno), agite.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10 min depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Lugar de 100 µ l de solução de heparina-PEG 3% em toda a superfície dos slides usando uma pipeta padrão.</li>
		<li>Examinar a superfície de heparina-PEG sob um microscópio de força atômica (uma frequência ressonante de 50 a 80 kHz, força constante de 0.350 N m 21, raio de ponta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse ilhéu engenharia de superfície com heparina-PEG nanocápsula
<ol><li>
Revestimento de superfície do mouse ilhéu com heparina-PEG nanocápsula
	<ol>
<li>Extrato de ilhotas do mouse pelo colagenase digestão e histopaque gradiente purificação como anteriormente relatada em JoVE19.</li>
		<li>Escolher 200 ilhotas sob um microscópio de dissecação de um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de PBS para os ilhéus e centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 250 µ l da solução de heparina-PEG e manter a mistura no gelo durante 10 min. pipeta acima e para baixo para permitir que os ilhéus misturar bem com a solução de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g por 1 min e remover o sobrenadante e manter os ilhéus para utilização posterior. Para exame de ilhotas do mouse revestido com heparina-PEG, FAM-heparina-PEG foi usado para o revestimento de ilhéu seguindo estas etapas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das ilhotas do mouse revestido com a nanocápsula FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Adicionar 1 a 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal para os ilhéus revestidos e transferir estas ilhotas em um prato de cultura bacteriana estéril não carregada.</li>
		<li>Observe os sinais de FAM-heparina-PEG revestido nanocápsula Ilhéus sob um microscópio de fluorescência invertido morfologia e fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. função de heparina-PEG revestido Mouse ilhotas comparadas com ilhotas não revestidos
<ol><li>
Viabilidade de heparina-PEG revestido ilhotas de rato
	<ol>
<li>Escolher a 20 dos ilhéus rato heparina-PEG revestido e colocá-los em um poço de uma placa de cultura de células 96 poços.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de rato de heparina-PEG revestido para cada poço.</li>
		<li>Escolher 20 das ilhotas de noncoated controle e colocá-los em um poço da placa de cultura de células 96 poços mesmo.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Colocar 200 µ l de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino em cada poço da placa de 96 poços que contém ilhotas e manter em cultura, durante 14 dias.</li>
		<li>Substitua o ilhéu de meios de cultura em 2 dias.</li>
		<li>Trate os ilhéus com um vivo/morto kit de coloração no final de 14 dias em cultura e observada sob um microscópio de fluorescência invertido.</li>
		<li>Contar células de PI+ (vermelho) dentro de cada ilhota debaixo de um microscópio de fluorescência invertido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularização de heparina-PEG revestido de ilhotas de rato em vitro
	<ol>
<li>Pré-fixe todos os plásticos experimentais incluindo placa de cultura e pontas da pipeta pelo menos 12 h antes da utilização.</li>
		<li>Coloque um lugar 24-bem uma ventoinha. Adicionar 250 µ l de gelo frio Matrigel reduzida de fator de crescimento em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Coloque a placa de 24 poços revestida a 4 ° C, durante pelo menos 30 min.</li>
		<li>Enquanto a solução de matriz é pôr na geladeira, trypsinize rato ilhota pancreatic milha Sven 1 (MS1) células endoteliais.<ol>
<li>Remova o frasco de cultura de tecidos, todos os meios de cultura. Lave o balão com 5 mL de PBS.</li>
			<li>Remover a PBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Incube a 37 ° C por 3 min em uma incubadora padrão.</li>
			<li>Bata levemente o fundo do frasco para separar as células e adicionar 5 mL de soro-completada a mídia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 5 mL de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar mídia DMEM soro-completados no tubo e semear 50.000 células em cada poço da placa de 24 poços matriz-solução-revestido.</li>
		<li>Adicione 5 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Adicione mídia DMEM soro-completada em cada poço para um total de 500 µ l por bem.</li>
		<li>Observe a formação do tubo após 4h e 24 h de incubação sob um microscópio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas de heparina-PEG revestido Nota: Para avaliar se a nanocápsula afetaria a função das ilhotas de rato, foi avaliada a secreção de insulina glicose-estimulada de heparina-PEG revestido e ilhotas de noncoated.<ol>
<li>Escolher 30 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de controle noncoated em um tubo de 1,5 mL. Prepare um total de 10 tubos para revestido ilhotas e Ilhéus noncoated cada.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de solução salina fisiológica, suplementada com 2 mmol/L glicose20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para a receita da solução salina fisiológica, por favor consulte a tabela 1. Mantenha a tampa dos tubos soltos durante a incubação na incubadora.</li>
		<li>Remova a solução tanto quanto possível.</li>
		<li>Estimula a Ilhéus, adicionando 600 µ l de solução salina fisiológica suplementado com 20 glicose mmol/L a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Colete 200 µ l do sobrenadante de cada tubo para quantificação de ELISA usando uma insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, demonstramos uma abordagem "fácil-para-adotar" para viver uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula de engenharia de superfície celular e a grupos amina da membrana de superfície de ilhotas pancreáticas. De facto, os grupos aminoácidos dentro das membranas celulares são altamente reativos e como consequência, estudos anteriores relataram interações entre grupos aminoácidos primários com registrados N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster sob condições fisiológicas14 ,16,21. Além disso, extensa pesquisa tem relatado que incorporação de heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatado e importante componente da matriz extracelular, durante o encapsulamento do Ilhéu, poderia levar a reforçada pós-transplante revascularização do miocárdio e redução IBMIR22,23. Considerando a biocompatibilidade de PEG e multivalentes Propriedades de heparina, usamos 8-armado PEG para heparina máxima de carregamento durante a fabricação da nanocápsula. Heparina foi modificada com -NHS, que posteriormente reagiria com os grupos de2 -NH na membrana celular de ilhéu. Permitindo a formação de ligação covalente entre -NH2 (membrana celular) e -NHS de Hep-PEG, os ilhéus iria ser prontamente "revestidos" pelo PEG heparina-incorporada, formando assim uma camada fina nano (nanocápsula) sobre a superfície externa do pâncreas Ilhéus.
A presente abordagem é diferente de métodos anteriormente publicados que também selecionou PEG como polímero principal para microencapsulação ilhéu nisso Chemistry de pseudo-opaco entre o -SNS (da nanocápsula) e -NH2 da célula ilhéu utilizou-se a membrana. Considerando que a estabilidade da ilha/célula revestimento, especialmente em um ambiente complexo como o plasma, é crucial para revascularização pós-transplante e sobrevivência, a formação entre -NHS e -NH2 seria mais estável em relação ao interação hidrofóbica entre a PEG e membrana celular24, interações eletrostáticas9,15,24,25,26 ou ligação biológica entre a biotina streptavidin14.
Além disso, em contraste com o ilhéu do revestimento que se baseia na abordagem LBL com período de tratamento estendido ilhéu para deposição de várias camadas14,16,25, a técnica presente também requer mínima processamento e muito curto período de revestimento dos ilhéus isolados. Ambos esses fatores são essenciais para a sobrevivência do Ilhéu pós-transplante desde viabilidade de ilhotas é frequentemente já comprometido isolamento ilhéu seguintes devido ao ECM danificado durante a digestão enzimática. No entanto, uma limitação da abordagem actual é que, ao contrário da LBL, através do qual a espessura do revestimento exterior podia ser controlada aumentando ou reduzindo o número de deposição de camada, espessura de nanocápsula o Hep-PEG não pode ser adaptada para o momento.
Além disso, devido à condição suave, onde a reação química entre o NHS - e -NH2 tem lugar, a abordagem actual é aplicável para a célula viva superfície engenharia não limitada de ilhotas pancreáticas, mas a maioria de terapia celular. Além disso, Considerando que a heparina é conhecida por interagir com uma variedade de citocinas e moléculas biologicamente ativas, a nanocápsula Hep-PEG também apresenta uma plataforma aberta que tem o potencial para a incorporação de mediadores biológicos ilimitadas, bem como interfaces para célula mais complexa engenharia de superfície.

O efeito terapêutico de terapias baseadas em células é limitado pela célula baixa retenção e sobrevivência pobre1,2. A fim de melhorar o resultado das terapias celulares, celular engenharia de superfície através de manipulação enzimática, conjugação de peptídeo, opaco química e físico encapsulamento com biomateriais tem sido explorado3,4, 5,6,7,8,9,10. O protocolo atual pretende atingir engenharia de superfície das células vivas, usando um método de "fácil-para-adotar" aplicando uma nanocápsula ultrafinos heparina-incorporada starPEG (heparina-PEG) à superfície da célula. Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas foi apresentada aqui como um exemplo devido a heterogeneidade das ilhotas de Langerhans e os resultados depreciativos da transplantação de ilhéu clínica atual.
Com efeito, ilhéu clínica transplante é atualmente realizado por injecção directa de ilhotas isoladas para a veia porta hepática e este procedimento só está disponível para pacientes seletivos por causa da escassez de materiais do doador e baixa eficácia terapêutica 11. convencionalmente, alginato tem sido o biomaterial mais comumente usado para o encapsulamento de ilhéu e modificação da superfície, embora seja menos que o ideal devido à instabilidade química do alginato e fibrose inflamatória relacionados12, 13. Além disso, em comparação com o tamanho natural de Ilhéus que varia entre 100 a 200 µm, as microcápsulas de alginato-ilhéu são maiores, variando entre 400 e 800 µm, que excedam a distância de difusão fisiológica de oxigênio. Encapsulamento de conformal ilhéu, ou seja., encapsulando ilhotas sem alteração significativa do volume de ilhota, foi então desenvolvido. Assim, a deposição de nanomembranes composto de PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicone ou nanocápsula multi-camadas (também conhecido como a técnica de "camada por camada" [LBL]) tem sido relatada, resultando em sobrevivência melhorada em vitro ilhéu14 ,15,16,17,18, embora a LBL abordagem muitas vezes requer ilhotas extensas período entregando para deposição de várias camadas, o que pode comprometer a viabilidade do Ilhéu . Além disso, a instabilidade do nanomembranes que se baseia em eletrostáticas ou covalentes interações entre camadas biomembrane ou interações hidrofóbicas entre nanomembranes e a superfície da ilha também gera preocupações9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Outro fator limitante que dificulta o resultado terapêutico do transplante de ilhotas intraportal é a instant mediada por sangue reação inflamatória (IBMIR) causada por contato direto de ilhotas implantados com sangue, resultando em agregação plaquetária, coagulação e efeito adverso imune ou ativação celular indesejadas9. Para resolver esses problemas, uma nanocápsula ultra fina composta de glicol de polietileno em forma de estrela (starPEG) foi preparada pela sua biocompatibilidade estabelecida e versatilidade como ilhéu material da carcaça. Heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatada, também foi incorporada na nanocápsula starPEG por suas propriedades anti-inflamatórias, anticoagulantes e capacidade de facilitar a vascularização através do recrutamento de fatores de crescimento angiogênico pro22, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Engenharia de superfície celular pode proteger implantado as células de ataque imune do hospedeiro. Ela também pode remodelar a paisagem celular para melhorar a função do enxerto e pós-transplante de sobrevivência. Este protocolo pretende atingir a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula ultrafinos starPEG heparina-incorporada (Hep-PEG). Para gerar a nanocápsula Hep-PEG para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas, succinato de grufo de heparina (heparina-NHS) foi sintetizado pela primeira vez modificação dos seus grupos carboxilato usando N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etil carbodiimida cloridrato de (EDC) e N- Hidroxisuccinimida (NHS). A mistura de Hep-PEG formou-se então por reticulação do starPEG de oito-armados de final-acrescida de amino (starPEG-(NH2)8) e heparina-NHS. Para o revestimento de superfície ilhéu, ilhotas de rato foram isoladas através de digestão de colagenase e purificação gradiente usando Histopaque. Ilhotas isoladas, em seguida, foram tratadas com solução fria de Hep-PEG gelo durante 10 minutos permitir a ligação covalente entre o SNS e os grupos amina da membrana celular de ilhéu. Nanocápsula com o Hep-PEG incorre mínima alteração do tamanho do Ilhéu e volume e heparinização dos ilhéus com Hep-PEG podem também reduzir instantânea reação inflamatória mediada por sangue durante o transplante de ilhotas. Esta abordagem "fácil-para-adotar" é ameno o suficiente para a engenharia de superfície de células vivas sem comprometer a viabilidade celular. Considerando que a heparina demonstrou afinidade de ligação para várias citocinas, a nanocápsula Hep-PEG também fornece uma plataforma aberta que permite a incorporação de mediadores biológicos funcionais ilimitados e superfícies multi-camadas para viver superfície celular bioengenharia.

A nanocápsula de heparina-PEG foi sintetizada pela conjugação de starPEG-(NH2)8 e heparina usando EDC e NHS como acoplamento agentes (Figura 1). Estrutura química da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por FT-IR e como mostrado na Figura 2, Picos característicos de heparina podem ser observados em 3.300 – 3.600 cm-1, correspondente aos grupos hidroxila de heparina (Figura 2 vermelho). A diminuição da amplitude do pico em 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 azul) representa a conjugação entre a starPEG-(NH2)8 grupos amida e grupo carbonila de heparina. Amplitude de pico 1.650 cm-1 corresponde a amida carbonila vibrações de alongamento também foi reduzida, indicando a reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com succinato de grufo e amina de starPEG-(NH2) 8. estrutura de superfície da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por microscopia de força atômica e é mostrado de Lou et al, a nanocápsula era aproximadamente 30 nm de altura e 2 µm de largura com pequenas características porosas (manchas escuras) que vão entre 100 a 200 nm em diâmetro10. Dados obtidos de microscopia eletrônica de varredura também confirmam a estrutura porosa altamente interconectada da cavilha de heparina (Figura 3), sugerindo que poderia ser apropriado para a sobrevivência da pilha durante a entrega em vivo.
Revestimento de superfície de ilhotas isoladas de rato foi examinado e conforme apresentado na Figura 4, uma camada fina de nanocápsula, mostrada por fluorescência verde foi depositada uniformemente através da superfície de ilhotas revestidas sem causar alterações evidentes na ilhota tamanho/volume. Durante o revestimento, é recomendável manter as ilhotas no gelo para manter a sua viabilidade. Da mesma forma, o período de revestimento, 10 min neste caso, foi também otimizado para permitir a manutenção da viabilidade de Ilhéus. É interessante notar que para melhor observação da nanocápsula, microscopia de elétron que examina as secções transversais de ilhotas revestidas como relatado anteriormente9,16 seria mais adequada, embora os dados seria gerados de ilhotas fixas e incorporadas em vez de viver ilhotas na cultura.
Relativamente à sobrevivência e função das ilhotas revestidas, revascularização ilhéu e funções em foram avaliados in vitro. Considerando as propriedades benéficas da heparina, functionalization de heparina para a superfície da ilha poderia facilitar a revascularização ilhéu da cultura e, consequentemente, a sua sobrevivência. Temos observado que os ilhéus de rato de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto na cultura (Figura 5). Significativamente mais avançado formação vascular era também evidente a partir de células endoteliais ilhéu (MS1) que co foram cultivadas com heparina-PEG revestido ilhotas, indicadas por estruturas microvessel alongadas e rede-como estruturas vasculares (Figura 6 ).
O processo de nanocápsula incorridos sem capacidade de secretoras de insulina glicose-estimulada com efeito dos ilhéus heparina-PEG revestido. Baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando ilhéus foram perfundidos com solução salina fisiológica, suplementada com sub-stimulatory nível de glicose (2 mmol/L; A Figura 7). Quando ilhéus foram estimulados com um nível suprafisiológica da glicose (glicose de 20 mmol/L), observou-se aumento da secreção de insulina em todos os grupos de tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estrutura química da Hep-PEG nanocápsula para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas. Revestimento de ilhéu foi conseguido através da reticulação ligações covalente entre o NHS de heparina e aminas primárias dentro da membrana celular e estrela - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina possui vários grupos carboxila, que foram modificados para ter um grupo de NHS cada. Os grupos carboxila NHS-ativado irão reagir com aminas primárias de proteína para ligações amida de formulário, através do qual é estabilizada nanocápsula de Hep-PEG e ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infravermelho da estrela - PEG-(NH2)8, heparina e Hep-PEG nanocápsula em seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de Hep-PEG no estado seco digitalizadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Imagens representativas de heparina-PEG revestido Ilhéus sob microscópio de fluorescência. Heparina foi previamente rotulada com FAM (mostrado em verde). Imagens são representativos de 100 ilhotas. Barra de escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Ilhotas de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto. (A) dados apresentados como média erro-padrão do meio, n = 50 ilhotas por grupo. (B) as células vivas foram mostradas em células e inoperante em vermelho. Barra de escala = 100 µm. imagens são representante de 50 ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocápsula facilita intrailhéu revascularisation. Formação de tubo Matrigel de células MS1 co cultivadas com heparina-PEG revestido Ilhéus e ilhotas de noncoated controle. Imagens foram tiradas do bar 4 e 24 h. escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocápsula incorre em nenhuma mudança na função de secreção de insulina ilhéu. Heparina-PEG revestido de Ilhéus e ilhotas noncoated controle (30 cada) foram expostas a 2 mmol/L (barra branca) ou 20 glicose mmol/L (barra preta) por 30 min. a secreção de insulina em resposta a 20 glicose mmol/L foi comparável entre o revestido e ilhotas de controle. Dados são mostrados como média ± erro padrão de meios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado

Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K visualizações.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Medicina

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioengenharia

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Imunologia e Infecção

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...