Agradecemos o apoio financeiro do fundos nacionais de ciências naturais da China (31770968) e a Tianjin pesquisa programa de Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabricação de heparina-incorporada Starpeg nanocápsula
<ol><li>
Síntese de succinato de grufo de heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina e dissolver em 2,0 mL de água destilada gelada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Misture as soluções NHS e EDC num balão de fundo redondo. Deixe a solução mista no banco na temperatura ambiente por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugue a mistura de EDC NHS no 5.031 x g durante 10 minutos remover o excesso de EDC e NHS.</li>
		<li>Adicione 30 mL de álcool etílico frio para a mistura solução e centrifugar 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repita duas vezes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de nanocápsula starPEG-heparina
	<ol>
<li>Adicione 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 para um balão de fundo redondo.</li>
		<li>Adicione 0,67 mL de heparina de 10% (p/v)-NHS no mesmo balão de fundo redondo.</li>
		<li>Coloque a solução mista de starPEG-(NH2)8 e heparina-NHS na incubadora a 25 ° C por 20 min obter uma solução clara com viscosidade. Nota: Para experimentos em que se exigia fluorescente etiquetada heparina (FAM-heparina), o processo de fabricação é o mesmo exceto que a estrela de (NH2) - PEG -8 foi dissolvido em água desionizada, suplementada com 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidil éster 0.1% (razão molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização de heparina-PEG nanocápsula por Fourier Transform espectroscopia no infravermelho (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de começar, lave o dispositivo de almofariz, pilão e granulação de ágata (pequenos discos com diâmetro de 13 mm) com acetona e água deionizada. Seque o vidro em um forno antes do uso.</li>
		<li>Amostra de heparina-PEG Mix aproximadamente 0,1 – 1% com 200 – 250 mg de pó fino de KBr.</li>
		<li>Coloque a mistura de KBr e heparina-PEG o almofariz de ágata e pulverizar finamente em pequenas pelotas com diâmetros de 2 µm.</li>
		<li>Transfira a mistura para um dispositivo de granulação. Aplica força de compressão elevada (8 T/cm2) em um vácuo por 1 – 2 min formar pelotas transparentes.</li>
		<li>Puxe gentilmente as pelotas de amostra longe o dispositivo de granulação. Tenha cuidado para não puxar demais para não se incorrer em rachaduras.</li>
		<li>Transferi as pelotas de amostra com muito cuidado para um Fourier Transform Infrared espectroscópio para determinar a estrutura química de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das estruturas internas porosas de heparina-PEG nanocápsula por microscopia eletrônica de varredura (SEM)
	<ol>
<li>Para os procedimentos a seguir, prepare-se pipetas e placa de cultura de células de 48-bem padrão.</li>
		<li>Pipete a solução de copolímero de heparina-PEG para os poços de uma placa de cultura de 48-bem.</li>
		<li>Congele a placa a-80 ° C por 24 h.</li>
		<li>Lypophilize as amostras a-50 ° C, em ambiente de vácuo (0,1 Pa) por 24 h.</li>
		<li>Espalhe as amostras através da superfície pegajosa de um esboço de alumínio.</li>
		<li>Revestir as amostras com ouro e observar sob o microscópio de elétron digitalizado para observar estruturas porosas internas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame da superfície de nanocápsula de heparina-PEG por microscopia de força atômica (AFM)
	<ol>
<li>Limpar as lâminas de vidro de sílica com solução de piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C por 40 min.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10min e depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Seca as lâminas por secagem a vácuo.</li>
		<li>Lave os slides com abundância solução 3-aminopropil-triethoxysilane (2% em tolueno), agite.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10 min depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Lugar de 100 µ l de solução de heparina-PEG 3% em toda a superfície dos slides usando uma pipeta padrão.</li>
		<li>Examinar a superfície de heparina-PEG sob um microscópio de força atômica (uma frequência ressonante de 50 a 80 kHz, força constante de 0.350 N m 21, raio de ponta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse ilhéu engenharia de superfície com heparina-PEG nanocápsula
<ol><li>
Revestimento de superfície do mouse ilhéu com heparina-PEG nanocápsula
	<ol>
<li>Extrato de ilhotas do mouse pelo colagenase digestão e histopaque gradiente purificação como anteriormente relatada em JoVE19.</li>
		<li>Escolher 200 ilhotas sob um microscópio de dissecação de um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de PBS para os ilhéus e centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 250 µ l da solução de heparina-PEG e manter a mistura no gelo durante 10 min. pipeta acima e para baixo para permitir que os ilhéus misturar bem com a solução de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g por 1 min e remover o sobrenadante e manter os ilhéus para utilização posterior. Para exame de ilhotas do mouse revestido com heparina-PEG, FAM-heparina-PEG foi usado para o revestimento de ilhéu seguindo estas etapas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das ilhotas do mouse revestido com a nanocápsula FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Adicionar 1 a 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal para os ilhéus revestidos e transferir estas ilhotas em um prato de cultura bacteriana estéril não carregada.</li>
		<li>Observe os sinais de FAM-heparina-PEG revestido nanocápsula Ilhéus sob um microscópio de fluorescência invertido morfologia e fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. função de heparina-PEG revestido Mouse ilhotas comparadas com ilhotas não revestidos
<ol><li>
Viabilidade de heparina-PEG revestido ilhotas de rato
	<ol>
<li>Escolher a 20 dos ilhéus rato heparina-PEG revestido e colocá-los em um poço de uma placa de cultura de células 96 poços.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de rato de heparina-PEG revestido para cada poço.</li>
		<li>Escolher 20 das ilhotas de noncoated controle e colocá-los em um poço da placa de cultura de células 96 poços mesmo.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Colocar 200 µ l de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino em cada poço da placa de 96 poços que contém ilhotas e manter em cultura, durante 14 dias.</li>
		<li>Substitua o ilhéu de meios de cultura em 2 dias.</li>
		<li>Trate os ilhéus com um vivo/morto kit de coloração no final de 14 dias em cultura e observada sob um microscópio de fluorescência invertido.</li>
		<li>Contar células de PI+ (vermelho) dentro de cada ilhota debaixo de um microscópio de fluorescência invertido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularização de heparina-PEG revestido de ilhotas de rato em vitro
	<ol>
<li>Pré-fixe todos os plásticos experimentais incluindo placa de cultura e pontas da pipeta pelo menos 12 h antes da utilização.</li>
		<li>Coloque um lugar 24-bem uma ventoinha. Adicionar 250 µ l de gelo frio Matrigel reduzida de fator de crescimento em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Coloque a placa de 24 poços revestida a 4 ° C, durante pelo menos 30 min.</li>
		<li>Enquanto a solução de matriz é pôr na geladeira, trypsinize rato ilhota pancreatic milha Sven 1 (MS1) células endoteliais.<ol>
<li>Remova o frasco de cultura de tecidos, todos os meios de cultura. Lave o balão com 5 mL de PBS.</li>
			<li>Remover a PBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Incube a 37 ° C por 3 min em uma incubadora padrão.</li>
			<li>Bata levemente o fundo do frasco para separar as células e adicionar 5 mL de soro-completada a mídia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 5 mL de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar mídia DMEM soro-completados no tubo e semear 50.000 células em cada poço da placa de 24 poços matriz-solução-revestido.</li>
		<li>Adicione 5 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Adicione mídia DMEM soro-completada em cada poço para um total de 500 µ l por bem.</li>
		<li>Observe a formação do tubo após 4h e 24 h de incubação sob um microscópio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas de heparina-PEG revestido Nota: Para avaliar se a nanocápsula afetaria a função das ilhotas de rato, foi avaliada a secreção de insulina glicose-estimulada de heparina-PEG revestido e ilhotas de noncoated.<ol>
<li>Escolher 30 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de controle noncoated em um tubo de 1,5 mL. Prepare um total de 10 tubos para revestido ilhotas e Ilhéus noncoated cada.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de solução salina fisiológica, suplementada com 2 mmol/L glicose20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para a receita da solução salina fisiológica, por favor consulte a tabela 1. Mantenha a tampa dos tubos soltos durante a incubação na incubadora.</li>
		<li>Remova a solução tanto quanto possível.</li>
		<li>Estimula a Ilhéus, adicionando 600 µ l de solução salina fisiológica suplementado com 20 glicose mmol/L a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Colete 200 µ l do sobrenadante de cada tubo para quantificação de ELISA usando uma insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, demonstramos uma abordagem "fácil-para-adotar" para viver uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula de engenharia de superfície celular e a grupos amina da membrana de superfície de ilhotas pancreáticas. De facto, os grupos aminoácidos dentro das membranas celulares são altamente reativos e como consequência, estudos anteriores relataram interações entre grupos aminoácidos primários com registrados N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster sob condições fisiológicas14 ,16,21. Além disso, extensa pesquisa tem relatado que incorporação de heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatado e importante componente da matriz extracelular, durante o encapsulamento do Ilhéu, poderia levar a reforçada pós-transplante revascularização do miocárdio e redução IBMIR22,23. Considerando a biocompatibilidade de PEG e multivalentes Propriedades de heparina, usamos 8-armado PEG para heparina máxima de carregamento durante a fabricação da nanocápsula. Heparina foi modificada com -NHS, que posteriormente reagiria com os grupos de2 -NH na membrana celular de ilhéu. Permitindo a formação de ligação covalente entre -NH2 (membrana celular) e -NHS de Hep-PEG, os ilhéus iria ser prontamente "revestidos" pelo PEG heparina-incorporada, formando assim uma camada fina nano (nanocápsula) sobre a superfície externa do pâncreas Ilhéus.
A presente abordagem é diferente de métodos anteriormente publicados que também selecionou PEG como polímero principal para microencapsulação ilhéu nisso Chemistry de pseudo-opaco entre o -SNS (da nanocápsula) e -NH2 da célula ilhéu utilizou-se a membrana. Considerando que a estabilidade da ilha/célula revestimento, especialmente em um ambiente complexo como o plasma, é crucial para revascularização pós-transplante e sobrevivência, a formação entre -NHS e -NH2 seria mais estável em relação ao interação hidrofóbica entre a PEG e membrana celular24, interações eletrostáticas9,15,24,25,26 ou ligação biológica entre a biotina streptavidin14.
Além disso, em contraste com o ilhéu do revestimento que se baseia na abordagem LBL com período de tratamento estendido ilhéu para deposição de várias camadas14,16,25, a técnica presente também requer mínima processamento e muito curto período de revestimento dos ilhéus isolados. Ambos esses fatores são essenciais para a sobrevivência do Ilhéu pós-transplante desde viabilidade de ilhotas é frequentemente já comprometido isolamento ilhéu seguintes devido ao ECM danificado durante a digestão enzimática. No entanto, uma limitação da abordagem actual é que, ao contrário da LBL, através do qual a espessura do revestimento exterior podia ser controlada aumentando ou reduzindo o número de deposição de camada, espessura de nanocápsula o Hep-PEG não pode ser adaptada para o momento.
Além disso, devido à condição suave, onde a reação química entre o NHS - e -NH2 tem lugar, a abordagem actual é aplicável para a célula viva superfície engenharia não limitada de ilhotas pancreáticas, mas a maioria de terapia celular. Além disso, Considerando que a heparina é conhecida por interagir com uma variedade de citocinas e moléculas biologicamente ativas, a nanocápsula Hep-PEG também apresenta uma plataforma aberta que tem o potencial para a incorporação de mediadores biológicos ilimitadas, bem como interfaces para célula mais complexa engenharia de superfície.

O efeito terapêutico de terapias baseadas em células é limitado pela célula baixa retenção e sobrevivência pobre1,2. A fim de melhorar o resultado das terapias celulares, celular engenharia de superfície através de manipulação enzimática, conjugação de peptídeo, opaco química e físico encapsulamento com biomateriais tem sido explorado3,4, 5,6,7,8,9,10. O protocolo atual pretende atingir engenharia de superfície das células vivas, usando um método de "fácil-para-adotar" aplicando uma nanocápsula ultrafinos heparina-incorporada starPEG (heparina-PEG) à superfície da célula. Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas foi apresentada aqui como um exemplo devido a heterogeneidade das ilhotas de Langerhans e os resultados depreciativos da transplantação de ilhéu clínica atual.
Com efeito, ilhéu clínica transplante é atualmente realizado por injecção directa de ilhotas isoladas para a veia porta hepática e este procedimento só está disponível para pacientes seletivos por causa da escassez de materiais do doador e baixa eficácia terapêutica 11. convencionalmente, alginato tem sido o biomaterial mais comumente usado para o encapsulamento de ilhéu e modificação da superfície, embora seja menos que o ideal devido à instabilidade química do alginato e fibrose inflamatória relacionados12, 13. Além disso, em comparação com o tamanho natural de Ilhéus que varia entre 100 a 200 µm, as microcápsulas de alginato-ilhéu são maiores, variando entre 400 e 800 µm, que excedam a distância de difusão fisiológica de oxigênio. Encapsulamento de conformal ilhéu, ou seja., encapsulando ilhotas sem alteração significativa do volume de ilhota, foi então desenvolvido. Assim, a deposição de nanomembranes composto de PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicone ou nanocápsula multi-camadas (também conhecido como a técnica de "camada por camada" [LBL]) tem sido relatada, resultando em sobrevivência melhorada em vitro ilhéu14 ,15,16,17,18, embora a LBL abordagem muitas vezes requer ilhotas extensas período entregando para deposição de várias camadas, o que pode comprometer a viabilidade do Ilhéu . Além disso, a instabilidade do nanomembranes que se baseia em eletrostáticas ou covalentes interações entre camadas biomembrane ou interações hidrofóbicas entre nanomembranes e a superfície da ilha também gera preocupações9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Outro fator limitante que dificulta o resultado terapêutico do transplante de ilhotas intraportal é a instant mediada por sangue reação inflamatória (IBMIR) causada por contato direto de ilhotas implantados com sangue, resultando em agregação plaquetária, coagulação e efeito adverso imune ou ativação celular indesejadas9. Para resolver esses problemas, uma nanocápsula ultra fina composta de glicol de polietileno em forma de estrela (starPEG) foi preparada pela sua biocompatibilidade estabelecida e versatilidade como ilhéu material da carcaça. Heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatada, também foi incorporada na nanocápsula starPEG por suas propriedades anti-inflamatórias, anticoagulantes e capacidade de facilitar a vascularização através do recrutamento de fatores de crescimento angiogênico pro22, 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Engenharia de superfície celular pode proteger implantado as células de ataque imune do hospedeiro. Ela também pode remodelar a paisagem celular para melhorar a função do enxerto e pós-transplante de sobrevivência. Este protocolo pretende atingir a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula ultrafinos starPEG heparina-incorporada (Hep-PEG). Para gerar a nanocápsula Hep-PEG para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas, succinato de grufo de heparina (heparina-NHS) foi sintetizado pela primeira vez modificação dos seus grupos carboxilato usando N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etil carbodiimida cloridrato de (EDC) e N- Hidroxisuccinimida (NHS). A mistura de Hep-PEG formou-se então por reticulação do starPEG de oito-armados de final-acrescida de amino (starPEG-(NH2)8) e heparina-NHS. Para o revestimento de superfície ilhéu, ilhotas de rato foram isoladas através de digestão de colagenase e purificação gradiente usando Histopaque. Ilhotas isoladas, em seguida, foram tratadas com solução fria de Hep-PEG gelo durante 10 minutos permitir a ligação covalente entre o SNS e os grupos amina da membrana celular de ilhéu. Nanocápsula com o Hep-PEG incorre mínima alteração do tamanho do Ilhéu e volume e heparinização dos ilhéus com Hep-PEG podem também reduzir instantânea reação inflamatória mediada por sangue durante o transplante de ilhotas. Esta abordagem "fácil-para-adotar" é ameno o suficiente para a engenharia de superfície de células vivas sem comprometer a viabilidade celular. Considerando que a heparina demonstrou afinidade de ligação para várias citocinas, a nanocápsula Hep-PEG também fornece uma plataforma aberta que permite a incorporação de mediadores biológicos funcionais ilimitados e superfícies multi-camadas para viver superfície celular bioengenharia.

A nanocápsula de heparina-PEG foi sintetizada pela conjugação de starPEG-(NH2)8 e heparina usando EDC e NHS como acoplamento agentes (Figura 1). Estrutura química da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por FT-IR e como mostrado na Figura 2, Picos característicos de heparina podem ser observados em 3.300 – 3.600 cm-1, correspondente aos grupos hidroxila de heparina (Figura 2 vermelho). A diminuição da amplitude do pico em 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 azul) representa a conjugação entre a starPEG-(NH2)8 grupos amida e grupo carbonila de heparina. Amplitude de pico 1.650 cm-1 corresponde a amida carbonila vibrações de alongamento também foi reduzida, indicando a reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com succinato de grufo e amina de starPEG-(NH2) 8. estrutura de superfície da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por microscopia de força atômica e é mostrado de Lou et al, a nanocápsula era aproximadamente 30 nm de altura e 2 µm de largura com pequenas características porosas (manchas escuras) que vão entre 100 a 200 nm em diâmetro10. Dados obtidos de microscopia eletrônica de varredura também confirmam a estrutura porosa altamente interconectada da cavilha de heparina (Figura 3), sugerindo que poderia ser apropriado para a sobrevivência da pilha durante a entrega em vivo.
Revestimento de superfície de ilhotas isoladas de rato foi examinado e conforme apresentado na Figura 4, uma camada fina de nanocápsula, mostrada por fluorescência verde foi depositada uniformemente através da superfície de ilhotas revestidas sem causar alterações evidentes na ilhota tamanho/volume. Durante o revestimento, é recomendável manter as ilhotas no gelo para manter a sua viabilidade. Da mesma forma, o período de revestimento, 10 min neste caso, foi também otimizado para permitir a manutenção da viabilidade de Ilhéus. É interessante notar que para melhor observação da nanocápsula, microscopia de elétron que examina as secções transversais de ilhotas revestidas como relatado anteriormente9,16 seria mais adequada, embora os dados seria gerados de ilhotas fixas e incorporadas em vez de viver ilhotas na cultura.
Relativamente à sobrevivência e função das ilhotas revestidas, revascularização ilhéu e funções em foram avaliados in vitro. Considerando as propriedades benéficas da heparina, functionalization de heparina para a superfície da ilha poderia facilitar a revascularização ilhéu da cultura e, consequentemente, a sua sobrevivência. Temos observado que os ilhéus de rato de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto na cultura (Figura 5). Significativamente mais avançado formação vascular era também evidente a partir de células endoteliais ilhéu (MS1) que co foram cultivadas com heparina-PEG revestido ilhotas, indicadas por estruturas microvessel alongadas e rede-como estruturas vasculares (Figura 6 ).
O processo de nanocápsula incorridos sem capacidade de secretoras de insulina glicose-estimulada com efeito dos ilhéus heparina-PEG revestido. Baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando ilhéus foram perfundidos com solução salina fisiológica, suplementada com sub-stimulatory nível de glicose (2 mmol/L; A Figura 7). Quando ilhéus foram estimulados com um nível suprafisiológica da glicose (glicose de 20 mmol/L), observou-se aumento da secreção de insulina em todos os grupos de tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estrutura química da Hep-PEG nanocápsula para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas. Revestimento de ilhéu foi conseguido através da reticulação ligações covalente entre o NHS de heparina e aminas primárias dentro da membrana celular e estrela - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina possui vários grupos carboxila, que foram modificados para ter um grupo de NHS cada. Os grupos carboxila NHS-ativado irão reagir com aminas primárias de proteína para ligações amida de formulário, através do qual é estabilizada nanocápsula de Hep-PEG e ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infravermelho da estrela - PEG-(NH2)8, heparina e Hep-PEG nanocápsula em seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de Hep-PEG no estado seco digitalizadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Imagens representativas de heparina-PEG revestido Ilhéus sob microscópio de fluorescência. Heparina foi previamente rotulada com FAM (mostrado em verde). Imagens são representativos de 100 ilhotas. Barra de escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Ilhotas de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto. (A) dados apresentados como média erro-padrão do meio, n = 50 ilhotas por grupo. (B) as células vivas foram mostradas em células e inoperante em vermelho. Barra de escala = 100 µm. imagens são representante de 50 ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocápsula facilita intrailhéu revascularisation. Formação de tubo Matrigel de células MS1 co cultivadas com heparina-PEG revestido Ilhéus e ilhotas de noncoated controle. Imagens foram tiradas do bar 4 e 24 h. escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocápsula incorre em nenhuma mudança na função de secreção de insulina ilhéu. Heparina-PEG revestido de Ilhéus e ilhotas noncoated controle (30 cada) foram expostas a 2 mmol/L (barra branca) ou 20 glicose mmol/L (barra preta) por 30 min. a secreção de insulina em resposta a 20 glicose mmol/L foi comparável entre o revestido e ilhotas de controle. Dados são mostrados como média ± erro padrão de meios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado

Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K visualizações.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

Vídeo: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Bioengenharia

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Engenharia de Tecidos de tumor estromal Microenvironment com Aplicação a invasão Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Síntese de nanofibras baseado em queratina de Engenharia Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...