Siamo grati per il sostegno finanziario del National Natural Science fondi della Cina (31770968) e Tianjin ricerca programma di Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabbricazione di eparina-incorporato Starpeg DFI
<ol><li>
Sintesi di succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesare 0,69 g dell'eparina e sciogliere in 2,0 mL di acqua deionizzata ghiacciata.</li>
		<li>Pesare 0,23 g di NHS e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Pesare 0,77 g di EDC e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni NHS ed EDC in un pallone. Lasciare la soluzione mista in panchina a temperatura ambiente per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di EDC NHS a 5.031 x g per 10 min rimuovere l'eccesso EDC e NHS.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di etanolo freddo per la soluzione di miscela e centrifugare a 5.031 x g per 10 min.<ol>
<li>Ripetere due volte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di DFI starPEG-eparina
	<ol>
<li>Aggiungere 1,0 mL di 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 in un pallone.</li>
		<li>Aggiungere 0,67 mL di 10% (p/v) eparina-NHS il pallone stesso.</li>
		<li>Posizionare la soluzione mista di starPEG-(NH2)8 ed eparina-NHS in un incubatore a 25 ° C per 20 minuti ottenere una soluzione limpida con viscosità. Nota: Per gli esperimenti in cui fluorescente contrassegnato eparina (FAM-eparina) è stato richiesto, la procedura di fabbricazione è lo stesso tranne per il fatto che le stelle (NH2) - PEG -8 è stato dissolto in acqua deionizzata completato con 5, paragrafo 6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (rapporto molare) di starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione di eparina-PEG DFI di Fourier Transform spettroscopia infrarossa (FT-IR)
	<ol>
<li>Prima di iniziare, è necessario sciacquare il dispositivo di mortaio, pestello e cubettatura di agata (piccoli dischi con diametro di 13 mm) con acetone e acqua deionizzata. Asciugare il vetro in un forno prima dell'uso.</li>
		<li>Campione di eparina-PEG mix circa 0,1-1% con 200 – 250 mg di polvere fine di KBr.</li>
		<li>Posizionare l'eparina-PEG e la miscela di KBr in agata mortaio e polverizzare finemente in piccole palline con diametri di 2 µm.</li>
		<li>Trasferire il composto in un dispositivo d'appallottolamento. Applicare una forza ad alta compressione (8 T/cm2) in un vuoto per 1 – 2 min formare palline trasparenti.</li>
		<li>Tirare delicatamente i pellet di campione dal dispositivo d'appallottolamento. Fare attenzione a non tirare troppo forte di non incorrere in rotture.</li>
		<li>Trasferire il pellet di campione molto attentamente uno spettroscopio infrarosso a trasformata di Fourier trasforma per determinare la struttura chimica del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame delle strutture interne porose di eparina-PEG nanorivestimenti da scansione microscopia elettronica (SEM)
	<ol>
<li>Per le seguenti procedure, preparare pipette e piastra di coltura standard 48-ben celle.</li>
		<li>Dispensare la soluzione di copolimero di eparina-PEG nei pozzetti di una piastra di coltura 48 pozzetti.</li>
		<li>Congelare la piastra a-80 ° C per 24 h.</li>
		<li>Lypophilize i campioni a-50 ° C in ambiente sottovuoto (0,1 Pa) per 24 h.</li>
		<li>Campioni si è diffusa su tutta la superficie appiccicosa di uno stub di alluminio.</li>
		<li>Rivestire i campioni con oro e osservare sotto il microscopio elettronico digitalizzato per osservare le strutture interne di porose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame della superficie nanorivestimenti eparina-PEG di microscopia a forza atomica (AFM)
	<ol>
<li>Pulire le lastre di vetro di silice con soluzione piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C per 40 min.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min e poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Asciugare i vetrini di essiccazione sotto vuoto.</li>
		<li>Lavare i vetrini con un sacco di soluzione 3-aminopropyl-trietossisilano (2% in toluene), agitare delicatamente.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Posto 100 µ l di soluzione di eparina-PEG del 3% su tutta la superficie delle diapositive utilizzando una pipetta standard.</li>
		<li>Esaminare la superficie di eparina-PEG sotto un microscopio a forza atomica (una frequenza di risonanza del 50 – 80 kHz, forza costante di 0,350 N m 21, raggio della punta di 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse isolotto Surface Engineering con eparina-PEG DFI
<ol><li>
Rivestimento di superficie dell'isolotto del mouse con eparina-PEG DFI
	<ol>
<li>Estrarre gli isolotti del topo di collagenasi digestione histopaque gradiente purificazione e come precedentemente segnalata in Giove19.</li>
		<li>Accuratamente 200 isolotti sotto un microscopio di dissezione in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di PBS al isolotti e centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 250 µ l di soluzione di eparina-PEG e mantenere la miscela in ghiaccio per 10 min. pipetta su e giù per consentire gli isolotti mescolare bene con la soluzione di eparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 500 µ l di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min e rimuovere il supernatante e mantenere gli isolotti per ulteriore uso. Per l'esame di isolotti di topo rivestito con l'eparina-PEG, FAM-eparina-PEG è stato utilizzato per il rivestimento di isolotto attenendosi alla seguente procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame di isolotti di topo rivestito con la DFI FAM-eparina-PEG
	<ol>
<li>Aggiungere 1 – 2 mL di RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale agli isolotti rivestiti e trasferire questi isolotti in un piatto di coltura batterica sterile non caricati.</li>
		<li>Osservare i segnali di fluorescenza e morfologia di FAM-eparina-PEG rivestite con DFI isolotti sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. funzione di eparina-PEG rivestito isolotti del topo rispetto agli isolotti Non rivestiti
<ol><li>
Redditività di eparina-PEG rivestito isolotti del topo
	<ol>
<li>Accuratamente 20 degli isolotti del mouse eparina-PEG rivestito e inserirli in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di topo di eparina-PEG rivestito per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Accuratamente 20 di isolotti di controllo noncoated e inserirli in un pozzetto della stessa piastra di coltura cellulare 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di controllo noncoated per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Mettere 200 µ l di RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti che contiene isolotti e mantenere nella cultura per 14 giorni.</li>
		<li>Sostituire i mezzi di coltura dell'isolotto ogni 2 giorni.</li>
		<li>Trattare gli isolotti con un live/dead kit di colorazione alla fine dei 14 giorni nella cultura e osservato sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
		<li>Contare le celle PI+ (rosso) all'interno di ogni isolotto sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rivascolarizzazione del eparina-PEG rivestito del mouse isolotti in vitro
	<ol>
<li>Pre-raffreddare tutta la plastica sperimentale compreso piastra di coltura e puntali almeno 12 ore prima dell'uso.</li>
		<li>Posto un luogo 24 pozzetti su un pad di raffreddamento. Aggiungere 250 µ l di ghiaccio freddo Matrigel ridotto fattore di crescita in tutti i pozzetti di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Posizionare la piastra 24 pozzetti rivestita a 4 ° C per almeno 30 min.</li>
		<li>Mentre la soluzione di matrice è l'impostazione in frigo, tripsinizzano il mouse endoteliale Mile Sven 1 (MS1) le cellule di Langerhans.<ol>
<li>Rimuovere tutti i terreni di coltura nel matraccio di cultura del tessuto. Risciacquare il matraccio con 5 mL di PBS.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 3 min in un incubatore standard.</li>
			<li>Battere leggermente il fondo del matraccio per staccare le cellule e aggiungere 5 mL di siero-completati media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 5 mL di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 1.000 x g per 5 min e prendere il sovranatante.</li>
		<li>Aggiungere file multimediali DMEM siero-completati nel tubo e seme 50.000 cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti matrix-soluzione-rivestito.</li>
		<li>Aggiungere 5 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere siero-completati DMEM media in ogni pozzetto per un totale di 500 µ l per pozzetto.</li>
		<li>Osservare la formazione del tubo dopo 4h a 24 h di incubazione sotto un microscopio chiaro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secrezione insulinica glucosio-mediata degli isolotti di eparina-PEG rivestito Nota: Per valutare se nanorivestimenti comprometterebbe la funzione di isolotti del topo, è stata valutata la secrezione insulinica glucosio-mediata di eparina-PEG rivestito e isolotti noncoated.<ol>
<li>Accuratamente 30 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in una provetta da 1,5 mL. Preparare un totale di 10 tubi per rivestite con isolotti e isolotti noncoated ciascuno.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione salina fisiologica completati con 2 mmol/L glucosio20 e incubare a 37 ° C per 2 h. Nota: Per la ricetta della soluzione salina fisiologica, fare riferimento alla tabella 1. Tenere il cappuccio di tubi allentati durante l'incubazione nell'incubatrice.</li>
		<li>Rimuovere quante più soluzioni possibili.</li>
		<li>Stimolare gli isolotti aggiungendo 600 µ l di soluzione salina fisiologica completati con 20 glucosio di mmol/L a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Raccogliere 200 µ l di supernatante da ciascuna provetta per insulina quantificazione ELISA utilizzando un'insulina commerciale ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).</li><li>Sarkar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+cell+homing.">Engineered cell homing.</a> Blood. 118 (25), 184-191 (2011).</li><li>Kato, M., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewiring+cell+adhesion.">Rewiring cell adhesion.</a> J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+membrane+engineering+for+cell+rolling+using+peptide+conjugation+and+tuning+of+cell-selectin+interaction+kinetics.">Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics.</a> Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).</li><li>Merzaban, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+glycan+engineering+of+neural+stem+cells+augments+neurotropism+and+improves+recovery+in+a+murine+model+of+multiple+sclerosis.">Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis.</a> Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).</li><li>Silvescu, C. I., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF+induces+membrane+expression+of+a+myeloperoxidase+glycvariant+that+operates+as+an+E-selectin+ligand+on+human+myeloid+cells.">G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+bioactive+multilayered+nanocoatings+on+pancreatic+islet+cells:+incorporation+of+alpha1-antitrypsin+into+the+coatings.">Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings.</a> Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+surface+bioengineering+with+a+heparin-incorporated+starPEG+nanofilm.">Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).</li><li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+strategies+aimed+at+reconstitution+of+the+beta-cell+compartment+in+type+1+diabetes.">Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Kizilel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+pancreatic+islets+with+nano-thin+functional+polyethylene+glycol+coatings+for+enhanced+insulin+secretion.">Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+encapsulation+enhances+allograft+survival+and+function+of+islets+transplanted+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).</li><li>Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+antifouling+coatings+on+stainless+steel+via+catechol-amine+reaction.">Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).</li><li>Zmuda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Gey, G. O., Gey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+of+human+normal+cells+and+tumor+cells+in+continuous+culture.+I.+Preliminary+report:+Cultivation+of+mesoblastic+tumors+and+normal+tissue+and+notes+on+methods+of+cultivation.">The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation.</a> Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+azide+incorporation+into+endogenous+RNase+A+via+a+"chemistry"+approach.">Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach.</a> Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchoring+of+vascular+endothelial+growth+factor+to+surface-immobilized+heparin+on+pancreatic+islets:+implications+for+stimulating+islet+angiogenesis.">Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+surface+heparinization+prevents+the+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+in+islet+transplantation.">Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation.</a> Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).</li><li>Asif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparinization+of+cell+surfaces+with+short+peptide-conjugated+PEG-lipid+regulates+thromboinflammation+in+transplantation+of+human+MSCs+and+hepatocytes.">Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes.</a> Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).</li><li>Teramura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulation+of+cells,+including+islets,+within+stable+ultra-thin+membrane+of+maleimide-conjugated+PEG-lipid+with+multifunctional+crosslinkers.">Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers.</a> Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).</li><li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+nanoencapsulation:+A+nanomedicine+technology+for+diabetes+research+and+management.">Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management.</a> Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, dimostriamo un approccio "facile da adottare" per vivere superficie cellulare un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI di ingegneria e il gruppi amminici di isole pancreatiche in superficie della membrana. Infatti, i gruppi amminici all'interno delle membrane delle cellule sono altamente reattivi, e di conseguenza, gli studi precedenti hanno segnalato interazioni tra gruppi amminici primari con attivato N- hydroxysuccinimidyl (NHS) estere in condizioni fisiologiche14 ,16,21. Inoltre, ricerche approfondite è segnalato che l'incorporazione di eparina, un glicosaminoglicano altamente solfatata e importante componente della matrice extracellulare, durante l'incapsulamento dell'isolotto, potrebbe portare a una maggiore post-trapianto rivascolarizzazione e ridotta IBMIR22,23. Considerando la biocompatibilità di PEG e multivalente proprietà dell'eparina, abbiamo usato PEG 8-armati per l'eparina massima di caricamento durante la fabbricazione del DFI. L'eparina è stata modificata con -NHS, che avrebbe successivamente reagire con i gruppi di2 -NH sulla membrana delle cellule dell'isolotto. Abilitando la formazione del legame covalente tra -NH2 (della membrana cellulare) e -NHS di Hep-PEG, gli isolotti sarebbero essere prontamente "rivestiti" dalla PEG eparina-incorporato, formando così uno strato sottile di nano (DFI) sulla superficie esterna della del pancreas isolotti.
L'approccio attuale è diverso dai metodi precedentemente pubblicati che hanno selezionato PEG come il polimero più importante per la microincapsulazione di isolotto in quanto chimica di pseudo-bioorthogonal tra il -NHS (di DFI) e -NH2 della cellula dell'isolotto membrana è stata utilizzata. Considerando che la stabilità della cellula dell'isolotto/rivestimento, soprattutto in un ambiente complesso come il plasma, è cruciale alla rivascolarizzazione post-trapianto e sopravvivenza, la formazione tra -NHS e -NH2 sarebbe più stabile rispetto al interazione idrofobica tra PEG e membrana cellulare24, interazioni elettrostatiche9,15,24,25,26 o legame biologico tra biotina streptavidina14.
Inoltre, a differenza dell'isolotto rivestimento approccio che si basa sull'approccio LBL con periodo di gestione estesa dell'isolotto per deposizione multistrato14,16,25, la tecnica attuale anche richiede minimo elaborazione e molto breve periodo di rivestimento degli isolotti isolati. Entrambi questi fattori sono essenziali per la sopravvivenza post-trapianto dell'isolotto poiché isolotti vitalità è spesso già compromessa seguente isolotto isolamento a causa di ECM danneggiati durante la digestione enzimatica. Tuttavia, una limitazione dell'attuale strategia è che, a differenza di LBL, tramite il quale lo spessore del rivestimento esterno potrebbe essere controllato aumentando o riducendo il numero di deposizione di strati, spessore del DFI Hep-PEG non può essere personalizzato per il momento.
Inoltre, a causa della condizione mite dove la reazione chimica tra -NHS e -NH2 si svolge, l'approccio attuale è applicabile per la cellula vivente superficie ingegneria non limitata di isole pancreatiche, ma la maggior parte della terapia cellulare. Inoltre, considerando che l'eparina è noto per interagire con una gamma di citochine e molecole biologicamente attive, il DFI Hep-PEG presenta anche una piattaforma aperta che ha il potenziale per l'incorporazione dei mediatori biologici illimitati così come interfacce per l'ingegneria delle superfici delle cellule più complessa.

L'efficacia terapeutica delle terapie basate sulle cellule è limitata dalla cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza1,2. Al fine di migliorare l'esito delle terapie cellulari, cell ingegneria delle superfici tramite manipolazione enzimatica, coniugazione del peptide, bioorthogonal chimica e fisica incapsulamento con biomateriali è stato sfruttato3,4, 5,6,7,8,9,10. L'attuale protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici delle cellule viventi, utilizzando un metodo "facile da adottare" applicando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (eparina-PEG) alla superficie delle cellule. Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici è stato presentato qui come esempio a causa della natura eterogenea delle isole di Langerhans e denigratori risultati del trapianto di insule pancreatiche clinica corrente.
Infatti, il trapianto dell'isolotto clinica attualmente viene eseguito tramite iniezione diretta degli isolotti isolati nella vena portale epatica e questa procedura è disponibile solo per i pazienti selettivi a causa della scarsità di donatori materiali e bassa efficacia terapeutica 11. convenzionalmente, alginato è stato il biomateriale più comunemente usato per l'incapsulamento dell'isolotto e modificazione superficiale, anche se è meno di ideale a causa della instabilità chimica di alginato e fibrosi infiammatorie legate12, 13. Inoltre, rispetto alla dimensione degli isolotti che varia da 100 a 200 µm, le microcapsule di alginato-isolotto sono più grandi, comprese tra 400 e 800 µm, che supera la distanza di diffusione fisiologica dell'ossigeno. Incapsulamento dell'isolotto conformal, vale a dire., incapsulamento isolotti senza alterazione significativa del volume dell'isolotto, è stato poi sviluppato. Così, deposizione di nanomembrane è composta da PEG, tetrafluoroetilene, membrana in silicone o multistrato DFI (noto anche come la tecnica di "strato-da-strato" [LBL]) sono stato segnalato, con conseguente miglioramento in vitro dell'isolotto sopravvivenza14 a ,15,16,17,18, anche se il LBL approccio spesso richiede vasti isolotti consegna periodo per la deposizione di strati multipli, che possono compromettere la vitalità dell'isolotto . Inoltre, instabilità di nanomembrane che si basa su interazioni elettrostatiche o covalente tra strati di biomembrane o interazioni idrofobiche tra Nanomembrane e la superficie dell'isolotto solleva inoltre preoccupazioni9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Un altro fattore limitante che appesantiscono il risultato terapeutico di trapianto dell'isolotto intraportal è istantanea sangue-mediata reazione infiammatoria (IBMIR) causata da contatto diretto degli isolotti impiantati con sangue, con conseguente aggregazione piastrinica, coagulazione ed effetto immune avverso o indesiderati attivazione cellulare9. Per risolvere questi problemi, un nanorivestimento ultra-sottile composto da stella-a forma di polietilene glicole (starPEG) è stato preparato per la sua biocompatibilità stabilito e versatilità come materiale dell'alloggiamento dell'isolotto. Eparina, un glicosaminoglicano altamente solfato, inoltre è stato incorporato nella DFI starPEG per le sue proprietà antinfiammatorie, anti-coagulante e la capacità di facilitare la vascolarizzazione di reclutamento di fattori di crescita pro-angiogenici22, 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Ingegneria di superficie cellulare può proteggere le cellule impiantate da attacco immune ospite. Esso può anche rimodellare il paesaggio cellulare per migliorare la funzione dell'innesto e sopravvivenza post-trapianto. Questo protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (Hep-PEG). Per generare il DFI Hep-PEG per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico, succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS) è stato sintetizzato per la prima volta tramite modifica dei gruppi carbossilato tramite-(3-dimethylamino propyl) N -N'-etilico carbodiimide cloridrato (EDC) e N- Idrossisuccinimide (NHS). La miscela di Hep-PEG si formò quindi di reticolazione del amminico funzionalizzati fine otto braccia starPEG (starPEG-(NH2)8) e l'eparina-NHS. Per il rivestimento superficiale dell'isolotto, isolotti del topo sono stati isolati tramite digestione della collagenosi e purificazione sfumatura utilizzando Histopaque. Gli isolotti isolati sono stati quindi trattati con soluzione di Hep-PEG fredda ghiaccio per 10 minuti consentire il legame covalente tra NHS e i gruppi amminici di membrana delle cellule dell'isolotto. DFI con Hep-PEG comporta alterazione minima alla dimensione dell'isolotto e volume ed eparinizzazione degli isolotti con Hep-PEG può anche ridurre la reazione infiammatoria mediata dal sangue immediata durante il trapianto dell'isolotto. Questo approccio "facile da adottare" è abbastanza mite per ingegneria delle superfici delle cellule viventi senza compromettere la vitalità cellulare. Considerando che l'eparina ha mostrato affinità di legame per citochine multiple, il DFI Hep-PEG fornisce anche una piattaforma aperta che consente l'incorporazione dei mediatori biologici funzionali illimitati e superfici multistrate per vivere superficie cellulare Bioingegneria.

Il DFI eparina-PEG fu sintetizzato da coniugazione del starPEG-(NH2)8 e l'eparina con EDC e NHS come accoppiamento agenti (Figura 1). Struttura chimica del DFI eparina-PEG è stato esaminato da FT-IR e come illustrato nella Figura 2, picchi caratteristici dell'eparina ha potuto essere osservati alle 3.300 – 3.600 cm-1, corrispondenti ai gruppi dell'idrossile dell'eparina (Figura 2 rosso). La diminuzione nell'ampiezza del picco a 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 blu) rappresenta la coniugazione tra il starPEG-(NH2)8 gruppi di ammide e il gruppo carbonilico dell'eparina. Ampiezza di picco 1.650 cm-1 corrisponde all'ammide carbonilico stretching vibrazione inoltre è stata ridotta, che indica una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato dell'eparina con succinimidyl succinato e ammina di starPEG-(NH2) 8. struttura superficiale di DFI l'eparina-PEG è stato esaminato secondo microscopia a forza atomica ed è indicato da Lou et al., il DFI era circa 30 nm in altezza e 2 µm di larghezza con piccole caratteristiche porosi (macchie scure) che vanno tra 100 e 200 nm in diametro10. I dati ottenuti dalla scansione microscopia elettronica inoltre confermano la struttura porosa altamente interconnessa del eparina-PEG (Figura 3), suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza delle cellule durante la consegna in vivo.
Rivestimento superficiale di isolotti isolati del topo è stato esaminato e come presentato in Figura 4, sottile strato di DFI, mostrato fluorescenza verde è stato depositato uniformemente su tutta la superficie degli isolotti rivestiti senza causare cambiamenti evidenti su isolotto/dimensione del volume. Durante la verniciatura, si consiglia di tenere gli isolotti sul ghiaccio per mantenere la loro vitalità. Allo stesso modo, il periodo di rivestimento, 10 min in questo caso, è stato anche ottimizzato per consentire il mantenimento della vitalità di isolotti. Vale la pena notare che per una migliore osservazione della nanotecnologia, la microscopia elettronica che esamina le sezioni trasversali degli isolotti rivestiti come precedentemente segnalato9,16 sarebbe più appropriata, anche se i dati verrebbero generati da isolotti fissi e incorporati invece di isolotti di vivere nella cultura.
Per quanto riguarda sopravvivenza e funzione delle funzioni in, rivascolarizzazione delle isole e isolotti rivestiti sono stati valutati in vitro. Considerando le proprietà benefiche dell'eparina, funzionalizzazione di eparina sulla superficie dell'isolotto potrebbe facilitare la rivascolarizzazione delle isole di cultura e di conseguenza la sopravvivenza. Abbiamo osservato che gli isolotti di eparina-PEG rivestito del mouse hanno esibito attuabilità robusto isolotto in cultura (Figura 5). Significativamente più avanzata formazione vascolare era evidente anche dalle cellule endoteliali dell'isolotto (MS1) che sono state co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolotti, indicati dalla forma allungata del microvessel-come le strutture e rete-come le strutture vascolari (Figura 6 ).
Il processo di DFI non sostenute capacità secretoria insulinica glucosio-mediata di effetto degli isolotti eparina-PEG rivestito. Basso livello di secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando isolotti sono stati irrorati con soluzione salina fisiologica completati con sub-stimulatory livello di glucosio (2 mmol/L; Figura 7). Quando gli isolotti sono stati stimolati con un livello di sovra-fisiologiche di glucosio (glucosio 20 mmol/L), aumento della secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Struttura chimica di Hep-PEG nanorivestimenti per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico. Rivestimento dell'isolotto è stata realizzata da reticolazione covalente tra l'eparina-NHS e ammine primarie all'interno della membrana cellulare e stelle - PEG-(NH2)8. Ogni molecola di eparina possiede più gruppi carbossilici, che sono stati modificati per avere un gruppo di NHS. Gruppi carbossilici attivati dal NHS reagiscono con le ammine primarie della proteina di legami ammidici modulo, tramite il quale sono stabilizzato nanorivestimenti Hep-PEG e isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Spettro infrarosso di stelle - PEG-(NH2)8, eparina e nanorivestimenti Hep-PEG in secchi stato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Immagini di microscopia elettronica di Hep-PEG nello stato essiccato digitalizzate. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative di eparina-PEG rivestito isolotti con microscopio a fluorescenza. L'eparina è stata pre-etichettata con FAM (mostrata in verde). Immagini sono rappresentative di 100 isolotti. Barra della scala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Isolotti di eparina-PEG rivestito ha esibito attuabilità robusto isolotto. (A) i dati presentati come errore standard mean± di mezzi, n = 50 isolotti per ogni gruppo. (B) le cellule viventi sono state mostrate in verde e morte celle in rosso. Barra della scala = 100 µm. immagini sono rappresentative di 50 isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Eparina-PEG nanorivestimenti facilita intra-isolotto revascularisation. Formazione del MS1 cellule co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolette e isolotti di controllo noncoated di tubo di Matrigel. Immagini sono state scattate a barra della scala h. 4 e 24 = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Eparina-PEG DFI non comporta nessun cambiamento sulla funzione di secrezione di insulina dell'isolotto. Eparina-PEG rivestiti isolette e isolotti di controllo noncoated (30) sono stati esposti a 2 mmol/L (barra bianca) o 20 glucosio di mmol/L (barra nera) per 30 min. secrezione di insulina in risposta a 20 mmol/L glucosio era comparabile fra il rivestimento e gli isolotti di controllo. I dati vengono visualizzati come media ± errore standard dei mezzi, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Views.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Ricerca

Bioingegneria

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Procedura per l'Ingegneria del polmone

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l'applicazione di Invasion Cancer Cell

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Trattamento delle strutture ligamentali con serum esercitato-condizionato: un modello di ingegneria tessuto transazionale

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden