Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

Siamo grati per il sostegno finanziario del National Natural Science fondi della Cina (31770968) e Tianjin ricerca programma di Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabbricazione di eparina-incorporato Starpeg DFI
<ol><li>
Sintesi di succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesare 0,69 g dell'eparina e sciogliere in 2,0 mL di acqua deionizzata ghiacciata.</li>
		<li>Pesare 0,23 g di NHS e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Pesare 0,77 g di EDC e sciogliere in 0,5 mL di acqua deionizzata ghiacciata in un pallone.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni NHS ed EDC in un pallone. Lasciare la soluzione mista in panchina a temperatura ambiente per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di EDC NHS a 5.031 x g per 10 min rimuovere l'eccesso EDC e NHS.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di etanolo freddo per la soluzione di miscela e centrifugare a 5.031 x g per 10 min.<ol>
<li>Ripetere due volte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di DFI starPEG-eparina
	<ol>
<li>Aggiungere 1,0 mL di 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 in un pallone.</li>
		<li>Aggiungere 0,67 mL di 10% (p/v) eparina-NHS il pallone stesso.</li>
		<li>Posizionare la soluzione mista di starPEG-(NH2)8 ed eparina-NHS in un incubatore a 25 ° C per 20 minuti ottenere una soluzione limpida con viscosità. Nota: Per gli esperimenti in cui fluorescente contrassegnato eparina (FAM-eparina) è stato richiesto, la procedura di fabbricazione è lo stesso tranne per il fatto che le stelle (NH2) - PEG -8 è stato dissolto in acqua deionizzata completato con 5, paragrafo 6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (rapporto molare) di starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caratterizzazione di eparina-PEG DFI di Fourier Transform spettroscopia infrarossa (FT-IR)
	<ol>
<li>Prima di iniziare, è necessario sciacquare il dispositivo di mortaio, pestello e cubettatura di agata (piccoli dischi con diametro di 13 mm) con acetone e acqua deionizzata. Asciugare il vetro in un forno prima dell'uso.</li>
		<li>Campione di eparina-PEG mix circa 0,1-1% con 200 – 250 mg di polvere fine di KBr.</li>
		<li>Posizionare l'eparina-PEG e la miscela di KBr in agata mortaio e polverizzare finemente in piccole palline con diametri di 2 µm.</li>
		<li>Trasferire il composto in un dispositivo d'appallottolamento. Applicare una forza ad alta compressione (8 T/cm2) in un vuoto per 1 – 2 min formare palline trasparenti.</li>
		<li>Tirare delicatamente i pellet di campione dal dispositivo d'appallottolamento. Fare attenzione a non tirare troppo forte di non incorrere in rotture.</li>
		<li>Trasferire il pellet di campione molto attentamente uno spettroscopio infrarosso a trasformata di Fourier trasforma per determinare la struttura chimica del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame delle strutture interne porose di eparina-PEG nanorivestimenti da scansione microscopia elettronica (SEM)
	<ol>
<li>Per le seguenti procedure, preparare pipette e piastra di coltura standard 48-ben celle.</li>
		<li>Dispensare la soluzione di copolimero di eparina-PEG nei pozzetti di una piastra di coltura 48 pozzetti.</li>
		<li>Congelare la piastra a-80 ° C per 24 h.</li>
		<li>Lypophilize i campioni a-50 ° C in ambiente sottovuoto (0,1 Pa) per 24 h.</li>
		<li>Campioni si è diffusa su tutta la superficie appiccicosa di uno stub di alluminio.</li>
		<li>Rivestire i campioni con oro e osservare sotto il microscopio elettronico digitalizzato per osservare le strutture interne di porose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame della superficie nanorivestimenti eparina-PEG di microscopia a forza atomica (AFM)
	<ol>
<li>Pulire le lastre di vetro di silice con soluzione piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C per 40 min.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min e poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Asciugare i vetrini di essiccazione sotto vuoto.</li>
		<li>Lavare i vetrini con un sacco di soluzione 3-aminopropyl-trietossisilano (2% in toluene), agitare delicatamente.</li>
		<li>Sonicare le diapositive in metanolo per 10 min poi nel toluene per 10 min.</li>
		<li>Posto 100 µ l di soluzione di eparina-PEG del 3% su tutta la superficie delle diapositive utilizzando una pipetta standard.</li>
		<li>Esaminare la superficie di eparina-PEG sotto un microscopio a forza atomica (una frequenza di risonanza del 50 – 80 kHz, forza costante di 0,350 N m 21, raggio della punta di 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse isolotto Surface Engineering con eparina-PEG DFI
<ol><li>
Rivestimento di superficie dell'isolotto del mouse con eparina-PEG DFI
	<ol>
<li>Estrarre gli isolotti del topo di collagenasi digestione histopaque gradiente purificazione e come precedentemente segnalata in Giove19.</li>
		<li>Accuratamente 200 isolotti sotto un microscopio di dissezione in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di PBS al isolotti e centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 250 µ l di soluzione di eparina-PEG e mantenere la miscela in ghiaccio per 10 min. pipetta su e giù per consentire gli isolotti mescolare bene con la soluzione di eparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 500 µ l di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 503 x g per 1 min e rimuovere il supernatante e mantenere gli isolotti per ulteriore uso. Per l'esame di isolotti di topo rivestito con l'eparina-PEG, FAM-eparina-PEG è stato utilizzato per il rivestimento di isolotto attenendosi alla seguente procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esame di isolotti di topo rivestito con la DFI FAM-eparina-PEG
	<ol>
<li>Aggiungere 1 – 2 mL di RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale agli isolotti rivestiti e trasferire questi isolotti in un piatto di coltura batterica sterile non caricati.</li>
		<li>Osservare i segnali di fluorescenza e morfologia di FAM-eparina-PEG rivestite con DFI isolotti sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. funzione di eparina-PEG rivestito isolotti del topo rispetto agli isolotti Non rivestiti
<ol><li>
Redditività di eparina-PEG rivestito isolotti del topo
	<ol>
<li>Accuratamente 20 degli isolotti del mouse eparina-PEG rivestito e inserirli in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di topo di eparina-PEG rivestito per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Accuratamente 20 di isolotti di controllo noncoated e inserirli in un pozzetto della stessa piastra di coltura cellulare 96 pozzetti.</li>
		<li>Riempire un totale di 10 pozzi con 20 isolotti di controllo noncoated per ciascun pozzetto.</li>
		<li>Mettere 200 µ l di RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti che contiene isolotti e mantenere nella cultura per 14 giorni.</li>
		<li>Sostituire i mezzi di coltura dell'isolotto ogni 2 giorni.</li>
		<li>Trattare gli isolotti con un live/dead kit di colorazione alla fine dei 14 giorni nella cultura e osservato sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
		<li>Contare le celle PI+ (rosso) all'interno di ogni isolotto sotto un microscopio a fluorescenza invertito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rivascolarizzazione del eparina-PEG rivestito del mouse isolotti in vitro
	<ol>
<li>Pre-raffreddare tutta la plastica sperimentale compreso piastra di coltura e puntali almeno 12 ore prima dell'uso.</li>
		<li>Posto un luogo 24 pozzetti su un pad di raffreddamento. Aggiungere 250 µ l di ghiaccio freddo Matrigel ridotto fattore di crescita in tutti i pozzetti di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Posizionare la piastra 24 pozzetti rivestita a 4 ° C per almeno 30 min.</li>
		<li>Mentre la soluzione di matrice è l'impostazione in frigo, tripsinizzano il mouse endoteliale Mile Sven 1 (MS1) le cellule di Langerhans.<ol>
<li>Rimuovere tutti i terreni di coltura nel matraccio di cultura del tessuto. Risciacquare il matraccio con 5 mL di PBS.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 3 min in un incubatore standard.</li>
			<li>Battere leggermente il fondo del matraccio per staccare le cellule e aggiungere 5 mL di siero-completati media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min.</li>
		<li>Prendere il sovranatante ed aggiungere 5 mL di PBS. Pipettare su e giù per amalgamare bene.</li>
		<li>Centrifugare a 1.000 x g per 5 min e prendere il sovranatante.</li>
		<li>Aggiungere file multimediali DMEM siero-completati nel tubo e seme 50.000 cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti matrix-soluzione-rivestito.</li>
		<li>Aggiungere 5 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere siero-completati DMEM media in ogni pozzetto per un totale di 500 µ l per pozzetto.</li>
		<li>Osservare la formazione del tubo dopo 4h a 24 h di incubazione sotto un microscopio chiaro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secrezione insulinica glucosio-mediata degli isolotti di eparina-PEG rivestito Nota: Per valutare se nanorivestimenti comprometterebbe la funzione di isolotti del topo, è stata valutata la secrezione insulinica glucosio-mediata di eparina-PEG rivestito e isolotti noncoated.<ol>
<li>Accuratamente 30 isolotti di eparina-PEG rivestito o isolotti di controllo noncoated in una provetta da 1,5 mL. Preparare un totale di 10 tubi per rivestite con isolotti e isolotti noncoated ciascuno.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione salina fisiologica completati con 2 mmol/L glucosio20 e incubare a 37 ° C per 2 h. Nota: Per la ricetta della soluzione salina fisiologica, fare riferimento alla tabella 1. Tenere il cappuccio di tubi allentati durante l'incubazione nell'incubatrice.</li>
		<li>Rimuovere quante più soluzioni possibili.</li>
		<li>Stimolare gli isolotti aggiungendo 600 µ l di soluzione salina fisiologica completati con 20 glucosio di mmol/L a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Raccogliere 200 µ l di supernatante da ciascuna provetta per insulina quantificazione ELISA utilizzando un'insulina commerciale ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, dimostriamo un approccio "facile da adottare" per vivere superficie cellulare un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI di ingegneria e il gruppi amminici di isole pancreatiche in superficie della membrana. Infatti, i gruppi amminici all'interno delle membrane delle cellule sono altamente reattivi, e di conseguenza, gli studi precedenti hanno segnalato interazioni tra gruppi amminici primari con attivato N- hydroxysuccinimidyl (NHS) estere in condizioni fisiologiche14 ,16,21. Inoltre, ricerche approfondite è segnalato che l'incorporazione di eparina, un glicosaminoglicano altamente solfatata e importante componente della matrice extracellulare, durante l'incapsulamento dell'isolotto, potrebbe portare a una maggiore post-trapianto rivascolarizzazione e ridotta IBMIR22,23. Considerando la biocompatibilità di PEG e multivalente proprietà dell'eparina, abbiamo usato PEG 8-armati per l'eparina massima di caricamento durante la fabbricazione del DFI. L'eparina è stata modificata con -NHS, che avrebbe successivamente reagire con i gruppi di2 -NH sulla membrana delle cellule dell'isolotto. Abilitando la formazione del legame covalente tra -NH2 (della membrana cellulare) e -NHS di Hep-PEG, gli isolotti sarebbero essere prontamente "rivestiti" dalla PEG eparina-incorporato, formando così uno strato sottile di nano (DFI) sulla superficie esterna della del pancreas isolotti.
L'approccio attuale è diverso dai metodi precedentemente pubblicati che hanno selezionato PEG come il polimero più importante per la microincapsulazione di isolotto in quanto chimica di pseudo-bioorthogonal tra il -NHS (di DFI) e -NH2 della cellula dell'isolotto membrana è stata utilizzata. Considerando che la stabilità della cellula dell'isolotto/rivestimento, soprattutto in un ambiente complesso come il plasma, è cruciale alla rivascolarizzazione post-trapianto e sopravvivenza, la formazione tra -NHS e -NH2 sarebbe più stabile rispetto al interazione idrofobica tra PEG e membrana cellulare24, interazioni elettrostatiche9,15,24,25,26 o legame biologico tra biotina streptavidina14.
Inoltre, a differenza dell'isolotto rivestimento approccio che si basa sull'approccio LBL con periodo di gestione estesa dell'isolotto per deposizione multistrato14,16,25, la tecnica attuale anche richiede minimo elaborazione e molto breve periodo di rivestimento degli isolotti isolati. Entrambi questi fattori sono essenziali per la sopravvivenza post-trapianto dell'isolotto poiché isolotti vitalità è spesso già compromessa seguente isolotto isolamento a causa di ECM danneggiati durante la digestione enzimatica. Tuttavia, una limitazione dell'attuale strategia è che, a differenza di LBL, tramite il quale lo spessore del rivestimento esterno potrebbe essere controllato aumentando o riducendo il numero di deposizione di strati, spessore del DFI Hep-PEG non può essere personalizzato per il momento.
Inoltre, a causa della condizione mite dove la reazione chimica tra -NHS e -NH2 si svolge, l'approccio attuale è applicabile per la cellula vivente superficie ingegneria non limitata di isole pancreatiche, ma la maggior parte della terapia cellulare. Inoltre, considerando che l'eparina è noto per interagire con una gamma di citochine e molecole biologicamente attive, il DFI Hep-PEG presenta anche una piattaforma aperta che ha il potenziale per l'incorporazione dei mediatori biologici illimitati così come interfacce per l'ingegneria delle superfici delle cellule più complessa.

L'efficacia terapeutica delle terapie basate sulle cellule è limitata dalla cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza1,2. Al fine di migliorare l'esito delle terapie cellulari, cell ingegneria delle superfici tramite manipolazione enzimatica, coniugazione del peptide, bioorthogonal chimica e fisica incapsulamento con biomateriali è stato sfruttato3,4, 5,6,7,8,9,10. L'attuale protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici delle cellule viventi, utilizzando un metodo "facile da adottare" applicando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (eparina-PEG) alla superficie delle cellule. Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici è stato presentato qui come esempio a causa della natura eterogenea delle isole di Langerhans e denigratori risultati del trapianto di insule pancreatiche clinica corrente.
Infatti, il trapianto dell'isolotto clinica attualmente viene eseguito tramite iniezione diretta degli isolotti isolati nella vena portale epatica e questa procedura è disponibile solo per i pazienti selettivi a causa della scarsità di donatori materiali e bassa efficacia terapeutica 11. convenzionalmente, alginato è stato il biomateriale più comunemente usato per l'incapsulamento dell'isolotto e modificazione superficiale, anche se è meno di ideale a causa della instabilità chimica di alginato e fibrosi infiammatorie legate12, 13. Inoltre, rispetto alla dimensione degli isolotti che varia da 100 a 200 µm, le microcapsule di alginato-isolotto sono più grandi, comprese tra 400 e 800 µm, che supera la distanza di diffusione fisiologica dell'ossigeno. Incapsulamento dell'isolotto conformal, vale a dire., incapsulamento isolotti senza alterazione significativa del volume dell'isolotto, è stato poi sviluppato. Così, deposizione di nanomembrane è composta da PEG, tetrafluoroetilene, membrana in silicone o multistrato DFI (noto anche come la tecnica di "strato-da-strato" [LBL]) sono stato segnalato, con conseguente miglioramento in vitro dell'isolotto sopravvivenza14 a ,15,16,17,18, anche se il LBL approccio spesso richiede vasti isolotti consegna periodo per la deposizione di strati multipli, che possono compromettere la vitalità dell'isolotto . Inoltre, instabilità di nanomembrane che si basa su interazioni elettrostatiche o covalente tra strati di biomembrane o interazioni idrofobiche tra Nanomembrane e la superficie dell'isolotto solleva inoltre preoccupazioni9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Un altro fattore limitante che appesantiscono il risultato terapeutico di trapianto dell'isolotto intraportal è istantanea sangue-mediata reazione infiammatoria (IBMIR) causata da contatto diretto degli isolotti impiantati con sangue, con conseguente aggregazione piastrinica, coagulazione ed effetto immune avverso o indesiderati attivazione cellulare9. Per risolvere questi problemi, un nanorivestimento ultra-sottile composto da stella-a forma di polietilene glicole (starPEG) è stato preparato per la sua biocompatibilità stabilito e versatilità come materiale dell'alloggiamento dell'isolotto. Eparina, un glicosaminoglicano altamente solfato, inoltre è stato incorporato nella DFI starPEG per le sue proprietà antinfiammatorie, anti-coagulante e la capacità di facilitare la vascolarizzazione di reclutamento di fattori di crescita pro-angiogenici22, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Ingegneria di superficie cellulare può proteggere le cellule impiantate da attacco immune ospite. Esso può anche rimodellare il paesaggio cellulare per migliorare la funzione dell'innesto e sopravvivenza post-trapianto. Questo protocollo mira a raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento ultrasottile eparina-incorporato starPEG (Hep-PEG). Per generare il DFI Hep-PEG per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico, succinato di succinimidyl eparina (eparina-NHS) è stato sintetizzato per la prima volta tramite modifica dei gruppi carbossilato tramite-(3-dimethylamino propyl) N -N'-etilico carbodiimide cloridrato (EDC) e N- Idrossisuccinimide (NHS). La miscela di Hep-PEG si formò quindi di reticolazione del amminico funzionalizzati fine otto braccia starPEG (starPEG-(NH2)8) e l'eparina-NHS. Per il rivestimento superficiale dell'isolotto, isolotti del topo sono stati isolati tramite digestione della collagenosi e purificazione sfumatura utilizzando Histopaque. Gli isolotti isolati sono stati quindi trattati con soluzione di Hep-PEG fredda ghiaccio per 10 minuti consentire il legame covalente tra NHS e i gruppi amminici di membrana delle cellule dell'isolotto. DFI con Hep-PEG comporta alterazione minima alla dimensione dell'isolotto e volume ed eparinizzazione degli isolotti con Hep-PEG può anche ridurre la reazione infiammatoria mediata dal sangue immediata durante il trapianto dell'isolotto. Questo approccio "facile da adottare" è abbastanza mite per ingegneria delle superfici delle cellule viventi senza compromettere la vitalità cellulare. Considerando che l'eparina ha mostrato affinità di legame per citochine multiple, il DFI Hep-PEG fornisce anche una piattaforma aperta che consente l'incorporazione dei mediatori biologici funzionali illimitati e superfici multistrate per vivere superficie cellulare Bioingegneria.

Il DFI eparina-PEG fu sintetizzato da coniugazione del starPEG-(NH2)8 e l'eparina con EDC e NHS come accoppiamento agenti (Figura 1). Struttura chimica del DFI eparina-PEG è stato esaminato da FT-IR e come illustrato nella Figura 2, picchi caratteristici dell'eparina ha potuto essere osservati alle 3.300 – 3.600 cm-1, corrispondenti ai gruppi dell'idrossile dell'eparina (Figura 2 rosso). La diminuzione nell'ampiezza del picco a 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 blu) rappresenta la coniugazione tra il starPEG-(NH2)8 gruppi di ammide e il gruppo carbonilico dell'eparina. Ampiezza di picco 1.650 cm-1 corrisponde all'ammide carbonilico stretching vibrazione inoltre è stata ridotta, che indica una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato dell'eparina con succinimidyl succinato e ammina di starPEG-(NH2) 8. struttura superficiale di DFI l'eparina-PEG è stato esaminato secondo microscopia a forza atomica ed è indicato da Lou et al., il DFI era circa 30 nm in altezza e 2 µm di larghezza con piccole caratteristiche porosi (macchie scure) che vanno tra 100 e 200 nm in diametro10. I dati ottenuti dalla scansione microscopia elettronica inoltre confermano la struttura porosa altamente interconnessa del eparina-PEG (Figura 3), suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza delle cellule durante la consegna in vivo.
Rivestimento superficiale di isolotti isolati del topo è stato esaminato e come presentato in Figura 4, sottile strato di DFI, mostrato fluorescenza verde è stato depositato uniformemente su tutta la superficie degli isolotti rivestiti senza causare cambiamenti evidenti su isolotto/dimensione del volume. Durante la verniciatura, si consiglia di tenere gli isolotti sul ghiaccio per mantenere la loro vitalità. Allo stesso modo, il periodo di rivestimento, 10 min in questo caso, è stato anche ottimizzato per consentire il mantenimento della vitalità di isolotti. Vale la pena notare che per una migliore osservazione della nanotecnologia, la microscopia elettronica che esamina le sezioni trasversali degli isolotti rivestiti come precedentemente segnalato9,16 sarebbe più appropriata, anche se i dati verrebbero generati da isolotti fissi e incorporati invece di isolotti di vivere nella cultura.
Per quanto riguarda sopravvivenza e funzione delle funzioni in, rivascolarizzazione delle isole e isolotti rivestiti sono stati valutati in vitro. Considerando le proprietà benefiche dell'eparina, funzionalizzazione di eparina sulla superficie dell'isolotto potrebbe facilitare la rivascolarizzazione delle isole di cultura e di conseguenza la sopravvivenza. Abbiamo osservato che gli isolotti di eparina-PEG rivestito del mouse hanno esibito attuabilità robusto isolotto in cultura (Figura 5). Significativamente più avanzata formazione vascolare era evidente anche dalle cellule endoteliali dell'isolotto (MS1) che sono state co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolotti, indicati dalla forma allungata del microvessel-come le strutture e rete-come le strutture vascolari (Figura 6 ).
Il processo di DFI non sostenute capacità secretoria insulinica glucosio-mediata di effetto degli isolotti eparina-PEG rivestito. Basso livello di secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando isolotti sono stati irrorati con soluzione salina fisiologica completati con sub-stimulatory livello di glucosio (2 mmol/L; Figura 7). Quando gli isolotti sono stati stimolati con un livello di sovra-fisiologiche di glucosio (glucosio 20 mmol/L), aumento della secrezione dell'insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Struttura chimica di Hep-PEG nanorivestimenti per ingegneria delle superfici dell'isolotto pancreatico. Rivestimento dell'isolotto è stata realizzata da reticolazione covalente tra l'eparina-NHS e ammine primarie all'interno della membrana cellulare e stelle - PEG-(NH2)8. Ogni molecola di eparina possiede più gruppi carbossilici, che sono stati modificati per avere un gruppo di NHS. Gruppi carbossilici attivati dal NHS reagiscono con le ammine primarie della proteina di legami ammidici modulo, tramite il quale sono stabilizzato nanorivestimenti Hep-PEG e isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Spettro infrarosso di stelle - PEG-(NH2)8, eparina e nanorivestimenti Hep-PEG in secchi stato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Immagini di microscopia elettronica di Hep-PEG nello stato essiccato digitalizzate. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Immagini rappresentative di eparina-PEG rivestito isolotti con microscopio a fluorescenza. L'eparina è stata pre-etichettata con FAM (mostrata in verde). Immagini sono rappresentative di 100 isolotti. Barra della scala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Isolotti di eparina-PEG rivestito ha esibito attuabilità robusto isolotto. (A) i dati presentati come errore standard mean± di mezzi, n = 50 isolotti per ogni gruppo. (B) le cellule viventi sono state mostrate in verde e morte celle in rosso. Barra della scala = 100 µm. immagini sono rappresentative di 50 isolotti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Eparina-PEG nanorivestimenti facilita intra-isolotto revascularisation. Formazione del MS1 cellule co-coltivate con eparina-PEG rivestito isolette e isolotti di controllo noncoated di tubo di Matrigel. Immagini sono state scattate a barra della scala h. 4 e 24 = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Eparina-PEG DFI non comporta nessun cambiamento sulla funzione di secrezione di insulina dell'isolotto. Eparina-PEG rivestiti isolette e isolotti di controllo noncoated (30) sono stati esposti a 2 mmol/L (barra bianca) o 20 glucosio di mmol/L (barra nera) per 30 min. secrezione di insulina in risposta a 20 mmol/L glucosio era comparabile fra il rivestimento e gli isolotti di controllo. I dati vengono visualizzati come media ± errore standard dei mezzi, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Views.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.

Video: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Ricerca

Medicina

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Bioingegneria

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Immunologia e infezioni

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Decellularizzazione senza detergenti del pancreas umano per la produzione di ECM su matrice extracellulare solubile

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Decellularizzazione senza detergenti del pancreas umano per la produzione di matrice extracellulare solubile (ECM)

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo

Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

Decellularizzazione senza detergenti del pancreas umano per la produzione di matrice extracellulare solubile (ECM)

Decellularizzazione senza detergenti del pancreas umano per la produzione di matrice extracellulare solubile (ECM)

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi