Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Funds of China (31770968) und Tianjin-Programm der Anwendung Forschungsgemeinschaft und Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. Herstellung von Heparin aufgenommen Starpeg NanoCoatings
<ol><li>
Synthese von Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS)
	<ol>
<li>Von Heparin 0,69 g abwiegen und in 2,0 mL eiskaltes deionisiertes Wasser auflösen.</li>
		<li>NHS 0,23 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>EDC 0,77 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>Mischen Sie die NHS und EDC-Lösungen in einem Rundboden-Kolben. Lassen Sie die gemischte Lösung auf der Bank bei Raumtemperatur für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die EDC NHS Mischung 5.031 x g für 10 min bis zum Exzess EDC und NHS zu entfernen.</li>
		<li>Die Mischung Lösung und Zentrifuge bei 5.031 X g für 10 min 30 mL kaltem Ethanol hinzufügen.<ol>
<li>Zweimal wiederholen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der StarPEG-Heparin NanoCoatings
	<ol>
<li>Ein Rundboden-Flasche 1,0 mL der 10 % (w/V) StarPEG-(NH2)8 hinzufügen.</li>
		<li>Die gleichen Rundboden-Flasche 0,67 mL 10 % (w/V) Heparin-NHS hinzufügen.</li>
		<li>Legen Sie die gemischte Lösung StarPEG-(NH2)8 und Heparin-NHS in einem Inkubator bei 25 ° C für 20 min bis eine klare Lösung mit Viskosität zu erhalten. Hinweis: Für Experimente in denen eindringmittel beschrifteten Heparin (FAM-Heparin) erforderlich war, ist das Verfahren der Herstellung gleich außer dass deionisiertes Wasser ergänzt mit 5 Absatz 6 - Sterne - PEG-(NH2)8 aufgelöst wurde Carboxyfluorescein N- Succinimidyl Ester 0,1 % (Molverhältnis) StarPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Charakterisierung von Heparin-PEG NanoCoatings durch Fourier transformieren Infrarotspektroskopie (FT-IR)
	<ol>
<li>Spülen Sie bevor Sie beginnen das Achat Mörser und Pistill Pelletierung Gerät (kleine Scheiben mit Durchmesser von 13 mm ab) mit Aceton und deionisiertes Wasser. Trocknen Sie das Glas in einem Ofen vor Gebrauch.</li>
		<li>Mix ca. 0,1 – 1 % Heparin-PEG Probe mit 200 – 250 mg feine KBr-Pulver.</li>
		<li>Legen Sie die Heparin-PEG und KBr Mischung im Achat Mörser und fein pulverisieren in kleinen Pellets mit einem Durchmesser von 2 µm.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mischung in ein Pelletierwerk Gerät. Gelten Sie hohe Druckkraft (8 T/cm2) in einem Vakuum für 1 – 2 min. transparent Pellets zu bilden.</li>
		<li>Ziehen Sie vorsichtig die Probe Pellets von dem Pelletierwerk Gerät fern. Achten Sie darauf, nicht zu schwer, Risse entstehen nicht zu ziehen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe-Pellets sehr sorgfältig auf ein Fourier transformieren Infrarot Spektroskop, Probe chemische Struktur zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der internen porösen Strukturen der Heparin-PEG NanoCoatings von gescannten Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
	<ol>
<li>Bereiten Sie für die folgenden Verfahren standard 48-Well Kultur Zellplatte und Pipetten.</li>
		<li>Pipette die Heparin-PEG-Copolymer-Lösung in die Vertiefungen einer Kultur 48-Well-Platte.</li>
		<li>Frieren Sie die Platte bei-80 ° C für 24 h.</li>
		<li>Lypophilize der Proben bei-50 ° C im Vakuum (0,1 Pa) für 24 h.</li>
		<li>Die klebrige Oberfläche ein Aluminium-Stub Proben verteilt.</li>
		<li>Die Proben mit Gold zu beschichten und beobachten unter dem gescannten Elektronenmikroskop, interne poröse Strukturen zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Untersuchung der Heparin-PEG NanoCoatings Oberfläche durch Rasterkraftmikroskopie (AFM)
	<ol>
<li>Silica-Glas-Objektträger mit Piranha-Lösung reinigen (70 % H2SO4, 30 % H2O2) bei 80 ° C für 40 Minuten.</li>
		<li>Beschallen Sie die Folien in Methanol für 10 min und dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien durch Vakuumtrocknung.</li>
		<li>Waschen Sie die Folien mit 3-Aminopropyl-Triethoxysilane Lösung (2 % in Toluol), schütteln Sie Sie leicht.</li>
		<li>Beschallen Sie Folien in Methanol für 10 min dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Platz 100 µL 3 % Heparin-PEG-Lösung über die Oberfläche der Folien mit einer standard-Pipette.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Oberfläche der Heparin-PEG unter einem Rasterkraftmikroskop (eine Resonanzfrequenz von 50 – 80 kHz, erzwingen ständige 0.350 N m 21, Spitze Radius von 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Maus Islet Oberflächentechnik mit Heparin-PEG NanoCoatings
<ol><li>
Maus Inselchen Oberflächenbeschichtung mit Heparin-PEG NanoCoatings
	<ol>
<li>Extrahieren Sie Maus Inselchen von Kollagenase Verdauung und Histopaque gradient Reinigung wie Jupiter19berichtet.</li>
		<li>200 Inseln unter einem Mikroskop Dissektion zu einer 1,5 mL-Tube aussuchen.</li>
		<li>Die Inseln und die Zentrifuge bei 503 X g für 1 min 500 µL PBS hinzufügen.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 250 µL der Heparin-PEG-Lösung hinzufügen und halten Sie die Mischung auf dem Eis für 10 min. Pipette rauf und runter, die Inseln mit den Heparin-PEG-Lösung gut mischen lassen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 503 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen des Überstands und 500 µL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>503 X g für 1 min zentrifugieren Sie und entfernen Sie den überstand zu und halten Sie die Inseln für die weitere Verwendung. Für die Prüfung der Maus Inselchen mit Heparin-PEG beschichtet diente FAM-Heparin-PEG Inselchen Beschichtung folgendermaßen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der Maus Inselchen mit dem FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 – 2 mL RPMI 1640 mit 10 % fötalen Rinderserum beschichtete Inselchen ergänzt und übertragen Sie diese Inseln in eine sterile Bakterienkultur nicht aufgeladen-Schale.</li>
		<li>Die Morphologie und Fluoreszenz Signale der FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet Inseln unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Funktion der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen im Vergleich zu unbeschichteten Inselchen
<ol><li>
Lebensfähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen
	<ol>
<li>Aussuchen Sie 20 der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 96-Well Zellplatte Kultur.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Aussuchen Sie 20 noncoated Kontrolle Inseln und legen Sie sie in einem Brunnen der gleichen 96-Well Kultur Zellplatte.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 noncoated Kontrolle Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Setzen Sie 200 µL RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die kleinen Inseln enthält und für 14 Tage in Kultur pflegen.</li>
		<li>Alle 2 Tage Inselchen Nährmedien zu ersetzen.</li>
		<li>Behandeln Sie die Inseln mit einem lebenden/Toten Färbung Kit am Ende der 14 Tage in Kultur und unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet.</li>
		<li>PI+ (rot) Zellen innerhalb jeder Insel unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu zählen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revaskularisation der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen in vitro
	<ol>
<li>Alle experimentellen Kunststoffe einschließlich Kultur Platte Vorkühlen und Pipette Tipps mindestens 12 h vor Gebrauch.</li>
		<li>Legen Sie einen 24-Well-Ort auf ein Kühlkissen. Fügen Sie 250 µL Eis kalt Wachstumsfaktor reduziert Matrigel in jede Vertiefung eine Kultur 24 Wohlen Zellplatte. Ort der beschichteten 24-Well-Platte bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten.</li>
		<li>Während die Matrixlösung im Kühlschrank untergeht, trypsinize der Maus pancreatic Islet Endothelzellen Mile Sven 1 (MS1).<ol>
<li>Entfernen Sie alle Nährmedien aus der Gewebekultur-Flasche. Spülen Sie das Fläschchen mit 5 mL PBS.</li>
			<li>Entfernen Sie die PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. Inkubation bei 37 ° C für 3 min in ein standard-Inkubator.</li>
			<li>Tippen Sie die Unterseite des Kolbens zu lösen die Zellen und 5 mL Serum ergänzt Medien.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1.000 X g für 5 min.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 5 mL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>Bei 1.000 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand abnehmen.</li>
		<li>Hinzufügen von Serum ergänzt DMEM Medien in das Rohr und Samen 50.000 Zellen in jede Vertiefung der Matrix-Lösung beschichtet 24-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie 5 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in jede Vertiefung.</li>
		<li>Insgesamt 500 µL pro Bohrloch Serum ergänzt DMEM Medien in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>Beobachten Sie Rohr-Bildung nach 4h und 24 h Inkubation unter einem Lichtmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glukose-stimulierten Insulinsekretion der Heparin-PEG beschichtet Inselchen Hinweis: Um festzustellen, ob NanoCoatings die Funktion der Maus Inselchen beeinträchtigt, wurde Glukose stimuliert Insulin-Sekretion von Heparin-PEG beschichtet und noncoated Inselchen bewertet.<ol>
<li>30 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in einem 1,5 mL Röhrchen aussuchen. Bereiten Sie insgesamt 10 Röhrchen für beschichtete Inselchen und noncoated Inseln.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL physiologischer Kochsalzlösung mit 2 Mmol/L Glucose20 ergänzt und Inkubation bei 37 ° C für 2 h. Hinweis: Für das Rezept der physiologischen Salzlösung, siehe Tabelle 1. Lassen Sie die Kappe der Rohre lose während der Inkubation im Brutschrank.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel Lösung, wie möglich.</li>
		<li>Stimulieren Sie Inseln durch Zugabe von 600 µL einer physiologischen Salzlösung mit 20 Mmol/L Glucose bei 37 ° C für 30 min ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie 200 µL des Überstandes aus jeder Tube für Insulin ELISA Quantifizierung mit einem kommerziellen Insulin ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel zeigen wir "einfach zu erlassen" Ansatz für lebende Zelle Oberflächentechnik ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen den N- Hydroxysuccinimide die NanoCoatings und die Amin Gruppen des Pankreas Inselchen Oberfläche Membran. In der Tat die Aminogruppen in Zellmembranen sind hochreaktiv und infolgedessen frühere Studien haben berichtet, dass Wechselwirkungen zwischen primären Aminogruppen mit aktivierten N- Hydroxysuccinimidyl (NHS) Ester unter physiologischen Bedingungen14 ,16,21. Darüber hinaus hat umfangreiche Forschungen berichtet, dass Einbau von Heparin, ein höchst sulfatierte Glykosaminoglykan und wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix, während Inselchen Kapselung zu verbesserten Posttransplantationsperiode führen könnte Revaskularisation und reduzierte IBMIR22,23. In Anbetracht der Biokompatibilität von PEG und mehrwertige Eigenschaften des Heparins haben wir 8-armigen PEG für maximale Heparin während der Fertigung der NanoCoatings Laden verwendet. Heparin wurde mit -NHS, modifiziert, die anschließend mit der -NH2 Gruppen auf Insel Zellmembran reagieren würde. Aktivieren die kovalente Bindung-Bildung -NH2 (der Zellmembran) bis -NHS die Hep-PEG, die Inseln leicht "beschichtet werden würde" durch die PEG Heparin eingearbeitet, wodurch es ein Nano-Dünnschicht (NanoCoatings) auf der äußeren Oberfläche des der Bauchspeicheldrüse Inselchen.
Der bisherige Ansatz unterscheidet sich von zuvor veröffentlichten Methoden, die auch PEG als die großen Polymer für Inselchen Mikroverkapselung in diesem Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen -NHS (von NanoCoatings) und NH -2 von der inselzelle ausgewählt Membran diente. Wenn man bedenkt, dass die Stabilität der inselzelle/Beschichtung, vor allem in einem komplexen Umfeld wie das Plasma ist entscheidend für die Post-Transplantation Revaskularisation und überleben, die Bildung zwischen -NHS und -NH2 wäre stabiler im Vergleich zu hydrophobe Wechselwirkung zwischen PEG und Zellmembran24, elektrostatische Wechselwirkungen9,15,24,25,26 oder biologische Verbindung zwischen biotin Streptavidin-14.
Darüber hinaus erfordert Beschichtung Ansatz, der auch auf der LBL-Ansatz mit erweiterten Inselchen Umgang mit Zeit für multi-Layer Deposition14,16,25, der heutigen Technik beruht im Gegensatz zur kleinen Insel minimal Verarbeitung und sehr kurze Beschichtung Periode der isolierten Inseln. Diese beiden Faktoren sind nach Transplantation Inselchen überlebenswichtig, da Inselchen Lebensfähigkeit oft bereits kompromittierten folgenden Inselchen Isolation aufgrund von beschädigten ECM während der enzymatischen Verdauung ist. Eine Einschränkung des derzeitigen Konzepts ist jedoch, dass im Gegensatz zu LBL, über die Dicke der äußeren Beschichtung gesteuert werden könnte, durch eine Erhöhung oder Verringerung der Zahl der Abscheidung von Schichten, Dicke der Hep-PEG NanoCoatings vorerst zugeschnitten werden kann nicht.
Darüber hinaus aufgrund der milden Zustand wo chemische Reaktion zwischen -NHS und -NH2 stattfindet, der bisherige Ansatz für lebende Zelle gilt Oberflächentechnik nicht auf Pankreas Inseln, aber die meisten Zelltherapie beschränkt. Zusätzlich, wenn man bedenkt, dass Heparin bekannt ist, mit einer Reihe von Zytokinen und biologisch aktiven Molekülen interagieren, Hep-PEG NanoCoatings stellt auch eine offene Plattform, die das Potenzial zur Aufnahme von unbegrenzten biologische Mediatoren sowie Schnittstellen für komplexere Zelle Oberflächentechnik.

Die therapeutische Wirksamkeit von zellbasierten Therapien wird durch niedrige Zelle Retention und Armen überleben1,2begrenzt. Um das Ergebnis von Zelltherapien verbessern, Zell-Oberflächentechnik durch enzymatische Manipulation, wurde Peptid Konjugation, Bioorthogonal Chemie und physikalischen Kapselung mit Biomaterialien ausgebeuteten3,4, 5,6,7,8,9,10. Das aktuelle Protokoll strebt Oberflächentechnik von lebenden Zellen mit einer "leicht zu erlassen" Methode durch die Anwendung einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Heparin-PEG) NanoCoatings auf der Zelloberfläche. Oberflächentechnik von Pankreas Inseln präsentierte sich hier als Beispiel aufgrund der Heterogenität der Langerhans-Inseln und die abfällige Ergebnisse der aktuellen klinischen inselversetzung.
In der Tat, klinischen inselversetzung erfolgt derzeit durch direkte Injektion von isolierten Inseln in die hepatische portalader und dieses Verfahren ist nur für ausgewählte Patienten wegen der Knappheit an Spender Materialien und geringe therapeutische Wirksamkeit 11. konventionell, Alginat wurde die am häufigsten verwendeten Biomaterial für Inselchen Kapselung und Oberflächenmodifikation, obwohl es aufgrund der chemischen Instabilität der Alginat und Fibrose im Zusammenhang mit entzündlichen12, weniger als ideal ist 13. Darüber hinaus sind im Vergleich zu der natürlichen Größe der Inseln, die zwischen 100 bis 200 µm, die Alginat-Inselchen Mikrokapseln größer, zwischen 400 und 800 µm, die überschreiten der physiologische diffundierende Entfernung von Sauerstoff. Winkeltreue Inselchen Kapselung, dh., Verkapselung Inseln ohne wesentliche Änderung des Inselchen Volumen, dann entwickelt wurde. So, Ablagerung von Nanomembranes bestehend aus PEG, Tetrafluorethylen, silikonmembrane oder mehrschichtige NanoCoatings (auch bekannt als die "Schicht für Schicht" [LBL] Technik) wurde berichtet, was zu verbesserter in-vitro- Insel überleben14 ,15,16,17,18, obwohl die LBL nähern oft erfordert umfangreiche Inselchen Übergabe Periode zur Abscheidung von mehreren Schichten, welche Insel Lebensfähigkeit gefährden können . Instabilität des Nanomembranes, von die abhängt, elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen zwischen Biomembran Schichten oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Nanomembranes und der kleinen Insel Oberfläche wirft darüber hinaus auch Bedenken9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Ein weiterer begrenzender Faktor, der das therapeutische Ergebnis der intraportal inselversetzung überfüllt ist die sofortige Blut-vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR) verursacht durch direkten Kontakt der implantierten Inselchen mit Blut, wodurch die Thrombozytenaggregation, Koagulation und Immunsystem negativ oder unerwünschte zellulären Aktivierung9. Um diese Probleme zu beheben, wurde eine ultradünne NanoCoatings bestehend aus sternförmigen Polyethylenglykol (StarPEG) für seine etablierten Biokompatibilität und Vielseitigkeit als Gehäusematerial Insel vorbereitet. Heparin, eine höchst sulfatierte Glykosaminoglykan, wurde auch die StarPEG NanoCoatings für seine entzündungshemmende, Antigerinnungsmittel Eigenschaften und Fähigkeit, Vaskularisation zu erleichtern durch die Rekrutierung von Pro-angiogene Wachstumsfaktoren22enthalten, 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Zelle Oberflächentechnik kann implantierte Zellen vor Gastgeber immun Angriffen schützen. Es kann auch Umformen, zelluläre Landschaft zur Verbesserung der Organfunktion und Überleben nach Transplantation. Dieses Protokoll zielt auf Oberflächentechnik der pankreatischen kleinen Inseln mit einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Hep-PEG) NanoCoatings. Um die Hep-PEG NanoCoatings für Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Oberflächentechnik zu generieren, Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS) wurde erstmals synthetisiert durch Änderung seiner carboxylat-Gruppen mit N-(3-dimethylamino propyl) -N'-Ethyl Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und N- Hydroxysuccinimide (NHS). Die Hep-PEG-Mischung wurde dann durch Vernetzung der amino Ende funktionalisiert achtarmigen StarPEG (StarPEG-(NH2)8) und Heparin-NHS gebildet. Zur Insel Oberflächenbeschichtung waren Maus Inselchen über Kollagenase Verdauung und gradient Reinigung mit Histopaque isoliert. Isolierte Inseln wurden dann mit Eis kalt Hep-PEG-Lösung für 10 min kovalente Bindung zwischen NHS und Amin Gruppen der Insel Zellmembran ermöglichen behandelt. NanoCoatings mit Hep-PEG verursacht minimale Änderung Inselchen Größe und Volumen und Heparinisierung der Inseln mit Hep-PEG können auch sofort Blut-vermittelte entzündliche Reaktion während der inselversetzung verringern. Dieser "einfach zu erlassen" Ansatz ist ohne Kompromisse bei der Zellviabilität mild genug für Oberflächentechnik lebender Zellen. Wenn man bedenkt, dass Heparin Bindungsaffinität zu mehreren Zytokinen gezeigt hat, die Hep-PEG NanoCoatings auch bietet eine offene Plattform, die Einbeziehung der unbegrenzten funktionale biologische Mediatoren und vielschichtige Flächen für Wohnen ermöglicht Zelloberfläche Bioengineering.

Die Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Konjugation von StarPEG-(NH2)8 und Heparin mit EDC und NHS als Kopplung Agenten (Abbildung 1) synthetisiert. Chemische Struktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde von FT-IR untersucht und wie in Abbildung 2dargestellt, zeichnete charakteristische Gipfel von Heparin bei 3.300 – 3.600 cm-1, entspricht die Hydroxylgruppen des Heparins (Abbildung 2 Rote). Die Abnahme der Amplitude des Peaks bei 3.300 – 3.600 cm-1 (Abbildung 2 blau) stellt Konjugation zwischen der StarPEG-(NH2)8 amidgruppen und Heparin Carbonylgruppe. Amplitude der Gipfel 1.650 cm-1 entspricht dem Amid Carbonyl stretching Vibration wurde ebenfalls reduziert, ausreichende Reaktion zwischen dem carboxylat-Gruppen von Heparin mit Succinimidyl Succinat und Amin StarPEG-(NH2) angibt 8. Oberflächenstruktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Rasterkraftmikroskopie untersucht und nachgewiesen wird von Lou Et Al., die NanoCoatings war etwa 30 nm in der Höhe und 2 µm Breite mit kleinen porösen Features (dunkle Flecken) bis hin zwischen 100 bis 200 nm im Durchmesser10. Daten aus gescannten elektronische Mikroskopie bestätigen auch die stark vernetzte poröse Struktur von Heparin-PEG (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass es für Überleben der Zellen während der in-vivo Geburt geeignet sein könnte.
Oberflächenbeschichtung von isolierten Maus Inselchen wurde untersucht und wie in Abbildung 4dargestellt, dünne Schicht NanoCoatings, durch grüne Fluoreszenz gezeigt wurde gleichmäßig über die Oberfläche der beschichteten Inselchen ohne dass offensichtliche Änderungen auf Insel Volumegröße hinterlegt. Bei der Beschichtung empfiehlt es sich, die kleinen Inseln auf Eis, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten zu halten. In ähnlicher Weise wurde der Beschichtung Periode, 10 min in diesem Fall auch optimiert, um Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Inseln ermöglichen. Es ist erwähnenswert, dass für bessere Beobachtung der NanoCoatings, Elektronenmikroskopie, die die Querschnitte der beschichteten Inselchen als zuvor gemeldeten9,16 untersucht mehr angebracht wäre, obwohl die Daten generiert werden würden von den festen und embedded Inseln statt lebenden Inselchen in der Kultur.
Zu überleben und Funktion des beschichteten Inseln, Inselchen Revaskularisation und Funktionen in wurden bewertet in Vitro. In Anbetracht der positiven Eigenschaften des Heparins könnte Heparin Funktionalisierung auf die Oberfläche der Insel Insel Revaskularisation in Kultur und folglich das Überleben erleichtern. Wir haben beobachtet, dass die Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen robuste Inselchen Lebensfähigkeit in Kultur (Abbildung 5) ausgestellt. Wesentlich weiter fortgeschritten vaskulären Bildung wurde auch von Endothelzellen Inselzellen (MS1), die zusammen mit Heparin-PEG gezüchtet wurden offensichtlich Inselchen, angezeigt durch längliche kapilläre-ähnliche Strukturen und netzwerkartige vaskulären Strukturen (Abbildung 6 beschichtet ).
NanoCoatings Prozess entstehen keine Wirkung Glukose stimuliert Insulin sekretorischen Fähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Inselchen. Niedrige Niveau der Insulin-Sekretion wurde in allen Behandlungsgruppen beobachtet, wenn Inselchen mit physiologischer Kochsalzlösung, ergänzt mit sub-stimulatory Niveau der Glukose (2 Mmol/L; durchblutet waren ( Abbildung 7). Wenn Inselchen mit einer supra-physiologischen Niveau der Glukose (20 Mmol/L Glucose) angeregt wurden, wurde die Erhöhung der Insulin-Sekretion in allen Behandlungsgruppen beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Chemische Struktur der Hep-PEG NanoCoatings für Oberflächentechnik pancreatic Islet. Insel-Beschichtung wurde durch kovalente Vernetzung zwischen den Heparin-NHS und primäre Amine innerhalb der Zellmembran und Sterne - PEG-(NH2)8erreicht. Jedes Molekül Heparin besitzt mehrere Carboxylgruppen, die verändert wurden, um eine NHS-Gruppe haben. Der NHS-aktivierten Carboxylgruppen reagiert mit primären Aminen des Proteins zu Form Amid Verbindungen, über die NanoCoatings von Hep-PEG und Inselchen stabilisiert wird. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Infrarot-Spektrum der Sterne - PEG-(NH2)8, Heparin und Hep-PEG NanoCoatings im getrockneten Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Abbildung 3: Gescannte elektronische Mikroskopie Bilder von Hep-PEG in getrocknetem Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Heparin-PEG beschichtet Inselchen unter Fluoreszenzmikroskop. Heparin wurde bereits beschriftet mit FAM (grün dargestellt). Bilder sind repräsentativ für 100 Inseln. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Abbildung 5: Heparin-PEG beschichtet Inselchen ausgestellt robuste Inselchen Lebensfähigkeit. (A) Daten als Mean± Standard-Fehler bedeutet, n = 50 Inseln pro Gruppe. (B) lebenden Zellen wurden in grün und tote Zellen in rot dargestellt. Maßstabsleiste = 100 µm. Bilder sind repräsentativ für 50 Inseln. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Abbildung 6: Heparin-PEG NanoCoatings erleichtert Intra-Inselchen Revaskularisation. Matrigel Rohr Neubildung von MS1 Co kultiviert mit Heparin-PEG beschichtet, kleinen Inseln und Inselchen noncoated Kontrolle. Bilder wurden an 4 und 24 h. Skala Bar = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Abbildung 7: Heparin-PEG NanoCoatings verursacht keine Veränderung auf Insel Sekretion Insulinfunktion. Heparin-PEG beschichtete Inselchen und noncoated Kontrolle Inselchen (30) 2 Mmol/L (weißer Balken) ausgesetzt waren oder 20 Mmol/L (schwarze Balken) Glukose für 30 min. Insulin-Sekretion in Reaktion auf 20 Mmol/L Glucose war vergleichbar zwischen der beschichteten und Inselchen zu kontrollieren. Daten erscheinen als Mittelwert ± Standardfehler des Mittel, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Aufrufe.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.

Serie: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Forschung

Biotechnik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...