Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating at JoVE.com

우리는 국립 자연 과학 중국 펀드 (31770968)와 천진 연구 프로그램의 응용 프로그램 기초 및 고급 기술 (17JCZDJC33400)의 재정 지원에 대 한 감사.

1. 헤 파 린 통합 Starpeg Nanocoating의 제조
<ol><li>
헤 파 린 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국)의 합성
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 이온된 수의 2.0 mL에 용 해 및 헤 파 린의 0.69 g 밖으로 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 0.5 mL에 용 해 및 보 건국의 0.23 g으로 무게.</li>
		<li>0.5 ml 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 분해 및 EDC의 0.77 g을 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 NHS 및 EDC 솔루션을 믹스. 실 온에서 30 분 동안 실 온에서 벤치에 혼합된 솔루션을 떠나.</li>
		<li>10 분 초과 EDC와 보 건국 제거 5,031 x g 에 EDC NHS 혼합물 원심</li>
		<li>혼합 솔루션을 10 분 동안 5,031 x g 에서 원심 분리기의 냉 에탄올 30 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>두 번 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG-헤 파 린 nanocoating의 준비
	<ol>
<li>둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>같은 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) 헤 파 린-NHS의 0.67 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>점도와 명확한 솔루션을 얻기 위해 20 분에 25 ° C에서 인큐베이터에 starPEG-(NH2)8 및 헤 파 린-보 건국의 혼합된 솔루션을 배치 합니다. 참고: 실험 붙일 레이블된 덤플링을 (FAM-헤 파 린) 필요 했다, 제작 절차는 같은 스타-말뚝-(NH2)8 은 물속에에서 녹아 있는 이온 5(6)-보충 carboxyfluorescein N-succinimidyl 에스테 르 0.1% (어 금 니 비율) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating의 특성
	<ol>
<li>시작 하기 전에, 아세톤 및 이온된 수 옥수 박격포와 유 봉 산 장치 (작은 디스크 직경 13 m m)를 씻어. 사용 하기 전에 오븐에서 유리를 건조.</li>
		<li>좋은 KBr 분말의 200-250 mg와 혼합 약 0.1-1% 덤플링을 못 샘플.</li>
		<li>옥수 박격포에는 헤 파 린-고 케이시 혼합물을 배치 하 고 2 µ m의 직경을 가진 작은 알 약으로 정밀 하 게 격파.</li>
		<li>Pelleting 장치에 혼합물을 전송 합니다. 투명 한 펠 릿을 형성 하기 위하여 1-2 분 동안 진공에서 높은 압축 힘 (8 T/c m2)를 적용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 당겨 pelleting 장치에서 샘플 펠 릿. 균열 발생을 하지 너무 하드 하지를 주의 해야 합니다.</li>
		<li>매우 신중 하 게는 푸리에 변환 적외선 분 광 기 샘플 화학 구조를 결정 하는 샘플 펠 릿 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스캔 한 전자 현미경 (SEM) 의해 덤플링을 못 nanocoating의 내부 다공성 구조 시험
	<ol>
<li>다음 절차에 대 한 표준 48-잘 셀 문화 접시와 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>48-잘 문화 접시의 우물에 헤 파 린 못 코 폴리머 솔루션을 플라스틱.</li>
		<li>24 h-80 ° C에서 플레이트를 고정 합니다.</li>
		<li>Lypophilize 진공 환경에서-50 ° C에서 샘플 (0.1 Pa) 24 h에 대 한.</li>
		<li>샘플 한 알루미늄 스텁의 스티커 표면에 걸쳐 확산.</li>
		<li>골드 샘플 코트 그리고 스캔 한 전자 현미경 내부 다공성 구조를 관찰 하 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating 표면 검사
	<ol>
<li>실리 카 유리 슬라이드 피 솔루션을 청소 (70% H2이렇게4, 30% H2O2) 40 분 동안 80 ° C에서.</li>
		<li>10 분 동안 메탄올 그리고 10 분 동안 톨루엔에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>진공 건조 하 여 슬라이드를 건조.</li>
		<li>3-aminopropyl-triethoxysilane 솔루션 (톨루엔에 2%), 부드럽게 흔들어 많은 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>메탄올 톨루엔 10 분에서 10 분 동안에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>표준 피 펫을 사용 하 여 슬라이드의 표면에 걸쳐 3% 덤플링을 못 솔루션의 장소 100 µ L.</li>
		<li>헤 파 린-못 된 원자 힘 현미경의 표면 검사 (50-80 kHz의 공 진 주파수 강제 0.350 N m 21, 600의 팁 반경 일정 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 섬 표면 공학 덤플링을 못 Nanocoating
<ol><li>
헤 파 린 못 nanocoating와 마우스 섬 표면 코팅
	<ol>
<li>콜라 소화와 histopaque 그라데이션 정화 이전 정돈19에 보고에 의해 마우스 독도 추출 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 해 부 현미경 200 독도 따</li>
		<li>독도를 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>상쾌한 떨어져가지고 가십시오 덤플링을 못 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 10 분 아래로 덤플링을 못 솔루션와 잘 섞어 독도 수 있도록 피 펫에 대 한 얼음에 혼합물을 유지.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 하 고 추가 사용 하기 위해 독도 유지. 마우스 독도 덤플링을 말뚝 코팅의 시험, FAM-헤 파 린-못 섬 코팅 다음 단계에 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 독도 식구 들-헤 파 린-말뚝 nanocoating 코팅의 시험
	<ol>
<li>보충 코팅된 독도 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 1640의 1-2 mL을 추가 하 고 이러한 독도 청구 비 살 균 세균성 문화 접시에 전송.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 nanocoating 코팅 독도 식구 들-헤 파 린-못의 형태 및 형광 신호를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 헤 파 린-말뚝의 기능 코팅 비 코팅 독도에 비해 마우스 독도
<ol><li>
헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 생존
	<ol>
<li>헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 20를 따 고 그들 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 채우십시오.</li>
		<li>Noncoated 제어 독도의 20를 따 고 그들 같은 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 noncoated 제어 독도 채우십시오.</li>
		<li>독도 포함 하는 96 잘 접시의 각 음에 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 RPMI 1640의 200 µ L를 넣어 고 14 일에 대 한 문화에서 유지 합니다.</li>
		<li>섬 문화 미디어 2 일 마다 교체 합니다.</li>
		<li>라이브/죽은 문화에서 14 일의 끝에 키트를 얼룩이 지 고 거꾸로 형광 현미경 관찰로 독도 취급 합니다.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 각 섬 내의 PI+ (적색) 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-말뚝의 revascularization 코팅 마우스 독도 체 외
	<ol>
<li>전 문화 접시를 포함 하 여 모든 실험 플라스틱을 냉각 하 고 피 펫 팁 사용 하기 전에 적어도 12 h.</li>
		<li>냉각 패드에 24-잘 장소를 놓습니다. 추가 250 µ L 얼음의 차가운 증가율 감소 Matrigel 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에. 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 코팅된 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
		<li>냉장고에서 매트릭스 솔루션을 설정 하는 동안 마우스 췌 장 섬 내 피 마일 스벤 1 (MS1) 세포 trypsinize.<ol>
<li>조직 배양 플라스 크에서 모든 문화 매체를 제거 합니다. PBS의 5 mL로 플라스 크를 씻어.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 트립 신-EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 표준 인큐베이터에서 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>가볍게 셀을 분리 하 여 혈 청 보충 미디어의 5 mL을 추가 플라스 크의 아래쪽을 누릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>오프는 상쾌한 고 PBS의 5 mL을 추가. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 이륙.</li>
		<li>튜브에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 하 고 행렬 솔루션 코팅 24-잘 접시의 각 음에 50000 셀 씨.</li>
		<li>각 우물에 5 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 추가 합니다.</li>
		<li>잘 당 500 µ L의 총 각 잘에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경 4 h 및 24 시간 보육 후 관 형성을 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-나무 못 코팅 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비 참고:을 nanocoating 마우스 독도의 기능에 영향을 미칠 것 이라고, 헤 파 린-코팅 고 noncoated 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비는 평가 됩니다.<ol>
<li>한 1.5 mL 튜브에 30 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 따. 10 튜브 코팅된 독도 대 한 총 및 noncoated 독도 준비 합니다.</li>
		<li>생리 적 소금물 2 mmol/L 포도 당20 보충의 1 mL을 추가 하 고 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 생리 적 소금물 제조 법에 대 한 참조 하십시오 표1. 느슨한 인큐베이터에서 부 화 하는 동안 튜브의 뚜껑을 유지.</li>
		<li>가능한 많은 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 37 ° C에서 20 mmol/L 포도 당으로 보충 하는 생리 적 소금물의 600 µ L을 추가 하 여 독도 자극.</li>
		<li>ELISA 정량화 상업 인슐린 ELISA를 사용 하 여 키트 인슐린에 대 한 각 관에서 상쾌한의 200 µ L를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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이 문서에서 설명 하는 생활을 위한 "쉬운-을 채택" 접근 세포 표면 덤플링을 통합 starPEG nanocoating는 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 간의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 엔지니어링 및 췌 장 섬 표면 막의 아민 그룹입니다. 실제로, 세포 막 내에서 아미노 그룹은 반응성이 매우 높은, 그리고 그 결과, 이전 연구 보고가 생리 조건14에서 활성화 된 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) 에스테 르 주 아미노 그룹 사이 상호 작용 ,,1621. 또한, 광범위 한 연구는 섬 캡슐화 동안 덤플링을 매우 sulphated glycosaminoglycan, 세포 외 매트릭스의 중요 한 분 대의 설립 향상 된 후 이식 이어질 수 보고 revascularization 그리고 감소 IBMIR22,23. 말뚝의 생체 적합성 및 헤 파 린의 multivalent 속성을 고려 하면 우리는 nanocoating의 제조 동안 로드 최대한 덤플링을 8 무장 못 사용. 헤 파 린-보 건국, 작은 섬 세포 막에-NH2 그룹과 반응 이후에 수정 되었다. 헤 파 린 통합 말뚝에 의해 공유 결합 형성 (세포 막)의-NH2 -NHS 형 간염-못의 사이 독도 것 쉽게 "코팅"을 함으로써 따라서는 췌장암의 외부 표면에 나노 얇은 레이어 (nanocoating)를 형성 독도입니다.
현재 방식은 다른 섬 미소-보 건국 (nanocoating)의 작은 섬 세포의-NH2 사이 그 의사 bioorthogonal 화학에 대 한 주요 폴리머로 못 선택 이전에 게시 방법 막 사용 되었다. 섬/셀의 그 안정성을 고려 하면 코팅, 플라즈마, 같은 복잡 한 환경에서 특히 중요 포스트 이식 revascularization 이며 생존, 보 건국-와-NH2 사이 형성 될 것 이라고 더 안정적인에 비해 세포 막이 고24, 정전기 상호 작용9,15,,2425,26 또는 생물 학적 연동 biotin 사이의 소수 성 상호 작용 streptavidin14.
또한, 섬 달리 코팅 접근 또한 멀티 레이어 증 착14,,1625, 현재 기술에 대 한 확장된 섬 처리 기간으로 LBL 방식을 사용 하는 필요 최소한의 처리 하 고 매우 짧은 코팅의 고립 된 독도의 기간. 이러한 요소 둘 다 이기 때문에 독도 생존 종종 이미 손상 된 다음 섬 고립 때문에 손상 된 ECM 효소 소화 하는 동안 후 이식 섬 생존을 위해 필수적입니다. 그러나, 현재 접근에의 한 제한, LBL을 통해 외부 코팅의 두께 증가 또는 층 증 착의 수를 감소에 의해 제어 수 달리 형 간염 페그 nanocoating의 두께 수 없습니다 맞출 시간이 되 고 이다.
또한, 보 건국-와-NH2 장소, 현재 접근 사이 화학 반응은 살아있는 세포에 대 한 적용 온화한 조건 때문 표면 하지 엔지니어링 췌 장의 작은 섬, 하지만 대부분 세포 치료 제한. 또한, 헤 파 린에 대 한 다양 한 cytokines 및 생물 학적 활성 분자와 상호 작용 알려져 고려, 형 간염 페그 nanocoating도 선물 잠재력이 무제한 생물 중재자의 설립에 대 한 오픈 플랫폼 뿐만 아니라 더 복잡 한 세포 표면 공학에 대 한 인터페이스입니다.

세포 기반 요법의 치료 효능은 낮은 세포 보존 및 가난한 생존1,2에 의해 제한 됩니다. 세포 치료의 결과 개선, 효소 조작 통해 표면 공학, 주문 펩 티 드 활용, bioorthogonal 화학 및 생체 재료와 물리적 캡슐화 되었습니다 악용된3,4, 5,6,7,8,,910. 현재 프로토콜 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (헤 파 린-PEG) nanocoating 세포 표면에 적용 하 여 "쉬운-을 채택" 방법을 사용 하는 살아있는 세포의 달성을 목표로 한다. 췌 장 독도의 표면 공학 제시 했다 독도 Langerhans과 현재 임상 작은 섬 이식의 비방 결과의 질적 특성으로 인해 예를 들어 여기.
실제로, 임상 작은 섬 이식 현재 격리 된 독도의 간 문맥으로 직접 주입 하 여 수행 되며이 절차만에 사용할 수 선택적 환자 기증자 재료와 낮은 치료 효능의 부족 때문에 11. 통상, alginate 되었습니다 섬 캡슐화 및 표면 수정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 소재 alginate과 관련 된 염증 성 섬유 증12, 화학 불안정성 때문 이상적 미만 이더라도 13. 또한, 100 ~ 200 µ m 사이 배열 하는 독도의 자연 크기에 비해, alginate 섬 microcapsules는 400와 800 µ m 사이 배열 하는 더 큰 산소의 생리 적 확산 거리를 초과 하는 있는. 등각 섬 캡슐화, 즉., 독도 섬 볼륨의 중요 한 변경 없이 캡슐화, 다음 개발 되었다. 따라서, nanomembranes의 페그, tetrafluoroethylene, 실리콘 막의 구성 또는 다층된 nanocoating (일컬어 "레이어-의해-레이어" [LBL] 기술) 향상 된 생체 외에서 섬 생존14 결과 보고 되었습니다. ,,1516,,1718, 비록는 LBL 자주 접근 필요 합니다 광범위 한 독도 섬 생존을 손상 될 수 있는 여러 층의 증 착에 대 한 기간 전달 . 또한, biomembrane 레이어 또는 nanomembranes 및 섬 표면 사이의 소수 성 상호 작용 사이 정전기 또는 공유 상호 작용에 의존 하는 nanomembranes의 불안정성 또한 우려9,14 제기 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Encumbers intraportal 섬 이식의 치료 결과 또 다른 제한 요소는 즉시 혈액 중재 염증 반응 (IBMIR) 이식된 독도 혈액, 혈소판, 결과와 직접 접촉에 의해 발생 응고 및 면역 부작용 또는 원치 않는 세포 활성화9. 이러한 문제를 해결 하기 위해 별 모양의 폴 리 에틸렌 글리콜 (starPEG)의 구성 하는 울트라 얇은 nanocoating 설립된 생체 적합성과 섬 소재 주택으로 다 준비 되었다. 헤 파 린, 매우 sulphated glycosaminoglycan, 또한 그것의 항 염증 제, 항 응고 제 속성과 vascularization 프로 신생 성장 인자22, 모집 하 여 촉진 수에 대 한 starPEG nanocoating에 통합 되었다 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

세포 표면 공학 호스트 면역 공격에서 이식된 세포를 보호할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 기능을 개선 하기 위해 셀룰러 가로 바꿀 수와 생존 후 이식. 이 프로토콜은 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (형 간염-PEG) nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 달성을 목표로 한다. 췌 장 섬 표면 공학에 대 한 형 간염 페그 nanocoating를 생성 하려면 덤플링을 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국) 처음 사용 하 여 N-(3-dimethylamino propyl)-그것의 카복실산 그룹의 수정에 의해 합성 되었다N'-에틸 carbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS). 형 간염 페그 혼합물 다음 아미노 끝 기능성된 8-무장 한 starPEG (starPEG-(NH2)8) 및 헤 파 린-보 건국의 가교에 의해 형성 되었다. 섬 표면 코팅, 마우스 독도 콜라 소화 및 Histopaque를 사용 하 여 그라데이션 정화를 통해 격리 했다. 격리 된 독도 다음 NHS와 작은 섬 세포 막의 아민 그룹 사이의 공유 바인딩 수 있도록 10 분 동안 얼음 감기 형 간염 페그 솔루션으로 치료 했다. Nanocoating 형 간염 페그와 부딪히는 섬 크기에 최소한의 변경 하 고 볼륨 및 형 간염 페그와 독도의 heparinization 또한 섬 이식 하는 동안 인스턴트 혈액 중재 염증 반응을 줄일 수 있습니다. "쉬운-을 채택" 이렇게 세포 생존 능력을 타협 하지 않고 충분히 살아있는 세포의 표면 공학에 대 한 가벼운입니다. 형 간염 페그 nanocoating 또한 무제한 기능 생물학 중재자 및 생활에 대 한 다층된 표면 관 수 있도록 개방형 플랫폼 제공 고려 덤플링을 여러 cytokines에 바인딩 선호도 보이고 있다, 세포 표면 생명 공학입니다.

헤 파 린 못 nanocoating starPEG-(NH2)8 , EDC와 보 건국 커플링 에이전트 (그림 1)으로 사용 하는 헤 파 린의 활용에 의해 합성 되었다. 헤 파 린 못 nanocoating의 화학 구조에 의해 FT-적외선 조사 되었다 그리고 그림 2에서 같이, 헤 파 린의 특성 피크 3300-3600 c m-1, 헤 파 린 (그림 2 의 수 산 기 그룹에 해당에서 관찰 될 수 있었다 빨간). (그림 2 블루) 3300-3600 c m-1 에서 피크의 진폭에 있는 감소는 starPEG-(NH2)8 아 미드 그룹 및 헤 파 린 생성 그룹 사이 활용을 나타냅니다. 아 미드에 해당 하는 피크 1650 c m-1 의 carbonyl 진동 스트레칭 또한 succinimidyl 호박으로 덤플링의 카복실산 그룹 및 starPEG-(NH2)의 아민 사이 충분 한 반응을 나타내는 감소 되었다 8. 헤 파 린 못 nanocoating의 표면 구조는 원자 힘 현미경 검사 법에 의해 시험 되었다 루 외에서 표시 하는는 nanocoating 약 30 nm 높이에 이르기까지 작은 다공성 기능 (검 버섯) 폭에서 2 µ m 100 ~ 200 사이 직경10nm. 스캔 한 전자 현미경 검사 법에서 얻은 데이터는 또한 vivo에서 전달 중 세포 생존에 적합 될 수 제안 덤플링을 페그 (그림 3)의 높은 상호 다공성 구조를 확인 합니다.
격리 된 마우스 독도의 표면 코팅 시험 되었다 고 그림 4에 제시 된으로 녹색 형광으로 표시 하는 nanocoating의 얇은 레이어 코팅된 독도의 표면에 걸쳐 섬 볼륨/크기에 분명 변화를 유발 하지 않고 예금은 균등 하 게. 코팅, 동안 그들의 생존을 유지 하기 위해 얼음에 독도 유지 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 코팅 기간 10 분이 경우에 최적화 되었다 독도 생존 능력의 유지 관리를 허용 하도록. 그것은 그는 nanocoating의 더 나은 관측을 위해 이전에 보고 된9,16 코팅된 독도의 횡단면을 검사 전자 현미경 검사 법 더 적절할 것, 비록 데이터 생성 협조할 문화에서 생활 독도 대신 열 한 고정 및 임베디드 대에서
에 관한 생존 및 코팅된 독도, 섬 revascularization 및 기능의 기능 평가 체 외되었습니다. 헤 파 린의 유익한 속성을 고려 하면 섬 표면 덤플링을 기능화 수 문화에 따라서 생존 섬 revascularization 용이 하 게. 우리는 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 전시 문화 (그림 5)에서 강력한 섬 생존을 관찰 했습니다. 훨씬 더 고급 혈관 형성은 헤 파 린-페그와 공동 경작 했다 섬 내 피 세포 (MS1)에서 또한 분명 코팅 독도, 길쭉한 microvessel 같은 구조와 같은 네트워크 혈관 구조 (그림 6에 표시 된 ).
Nanocoating 프로세스 덤플링을 말뚝 코팅 독도의 효과 포도 당 자극 인슐린 분 비 능력을 발생합니다. 인슐린 분 비의 낮은 수준 때 독도 생리 적 소금물 포도 (2 mmol/L;의 sub-stimulatory 수준으로 보충을 끼얹는다 했다 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다 그림 7)입니다. 독도 포도 당 (20 mmol/L 포도 당)의 위에 생리 적 수준으로 자극 했다, 인슐린 분 비의 증가 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> 그림 1: 형 간염 페그 nanocoating 췌 장 섬 표면 공학의 화학 구조. 섬 코팅 덤플링을 NHS 및 세포 막 및 스타-말뚝-(NH2)8주 아민 사이 화학식 가교에 의해 달성 되었다. 각 헤 파 린 분자는 각 NHS 그룹을 수정 하는 여러 carboxyl 그룹을 소유한 다. NHS 활성화 carboxyl 그룹 폼 아 미드 결합를 통해 nanocoating 형 간염-고 독도의 안정화는 단백질의 1 차 아민과 반응 것 이다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> 그림 2 : 스타-말뚝-(NH2)8, 헤 파 린에 형 간염 페그 nanocoating의 적외선 스펙트럼의 건조 상태. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> 그림 3: 형 간염-못 말린된 상태에서의 전자 현미경 이미지를 스캔. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> 그림 4: 헤 파 린-말뚝의 대표 이미지 코팅 형광 현미경 독도. 헤 파 린 식구 들 (녹색에서 표시)와 함께 사전 이라는 했다. 이미지는 100 독도의 대표. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> 그림 5: 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 전시 강력한 섬 생존. (A) 데이터의 의미, n mean± 표준 오류로 그룹당 50 독도 =. (B) 살아있는 세포는 빨강에서 녹색 및 죽은 세포에 표시 했다. 눈금 막대 = 100 µ m 이미지는 50 독도의 대표. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> 그림 6: 헤 파 린 못 nanocoating 용이 내 섬 revascularisation. MS1 셀 헤 파 린-나무 못 코팅 독도와 noncoated 제어 독도 공동 경작의 Matrigel 튜브 형성. 이미지 4와 24 h. 규모 바에서 찍은 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> 그림 7: 헤 파 린 못 nanocoating 섬 인슐린 분 비 기능에 변화를 발생 시킵니다. 헤 파 린-나무 못 코팅된 독도 및 noncoated 제어 독도 (각 30) 2 mmol/L (흰색 막대)에 노출 됐다 또는 30 분 응답 20 mmol/L 포도 당으로 인슐린 분 비에 대 한 20 mmol/L (검은 막대) 포도 코팅 사이 비교 했다 고 독도 제어. 데이터의 의미, n 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다 = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K 조회수.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. 이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

연구

의학

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

생체공학

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

면역학 및 감염병학

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

생물학

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...