Este estudio describe el aislamiento de la arteria intrapulmonar de rata y las células del músculo liso vascular. Se emplearon varios protocolos experimentales, como el uso de la técnica de baño de órganos para investigar la respuesta vascular de la arteria intrapulmonar. Las arterias intrapulmonares y las células del músculo liso vascular son excelentes modelos para estudiar la fisiología vascular y la fisiopatología.
Las adaptaciones de esta técnica podrían evaluar las respuestas vasculares de cualquier fármaco, extracto o fitoquímicos. El montaje del anillo arterial intrapulmonar aislado en un baño de órganos permite el uso de arterias intrapulmonares aisladas para evaluar el papel de un fármaco en la modulación de diversas enfermedades, incluida la hipertensión pulmonar. Los protocolos experimentales son técnicamente factibles, pero los pasos cruciales son complicados y esenciales para el éxito, por lo que tener una demostración visual hace que sea más fácil de entender y seguir.
Demostrando el procedimiento estará Kittiwoot To-on, un estudiante de maestría en fisiología del Laboratorio de la Unidad de Investigación Cardiovascular, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan. Comience cortando un solo lóbulo del pulmón con tijeras de 11 centímetros y colocándolo en una placa de Petri de nueve centímetros con el lado medial, o raíz del pulmón, hacia arriba. Observe e identifique la alineación de la vena, los bronquios y la arteria de arriba a abajo.
Abra el bronquio longitudinalmente con tijeras. Luego use las pinzas de 11 centímetros para agarrar la punta del bronquio. Diseccionar suavemente y extraer el bronquio y las venas del pulmón.
Use los fórceps para agarrar la punta de la arteria intrapulmonar y diseccionarla cuidadosamente del tejido pulmonar con tijeras. Mantenga la arteria intrapulmonar aislada en una solución fría de Krebs hasta que se configure el conjunto del baño de órganos. Después de aislar la arteria intrapulmonar, abra la rama principal de la arteria intrapulmonar longitudinalmente con las tijeras de 11 centímetros y córtela en tiras de dos milímetros.
Sumerja las tiras de la arteria intrapulmonar en DM, luego incube las tiras durante una hora a cuatro grados Celsius en DM que contienen un miligramo por mililitro de papaína, 0.04% BSA y 0.4 milimolar DTT. Luego incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue un miligramo por mililitro de colagenasa tipo IA en DM, y nuevamente incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Transfiera los tejidos a MS fresca y disperse mediante una trituración suave con una pipeta de vidrio Pasteur. Siga triturando hasta que las células aisladas del músculo liso vascular se hagan visibles en la solución de baño bajo el microscopio. Aislar la arteria intrapulmonar como se demostró anteriormente y cortar la rama principal de la arteria intrapulmonar en anillos de aproximadamente dos milímetros de longitud.
Fije los anillos de la arteria intrapulmonar en las cámaras de baño de órganos enroscándolos en dos cables de acero inoxidable de 40 micrómetros de diámetro. Acople cables de acero inoxidable montados con anillos arteriales intrapulmonares a los transductores de fuerza isométrica conectados al dispositivo de adquisición de datos y al sistema informático instalado con el software fisiológico adecuado para el registro y análisis de datos. Luego eleve suavemente la tensión del anillo de la arteria intrapulmonar a un gramo.
Deje que los segmentos del vaso se equilibren durante unos 45 minutos a una tensión en reposo de un gramo. Durante el período de equilibrio, asegúrese de que la solución de Krebs se cambie regularmente cada 15 minutos. Después del equilibrio, pruebe la viabilidad de los vasos midiendo su vasoconstricción a una solución de potasio extracelular alta.
Evaluar la presencia o ausencia de endotelio calculando la respuesta de relajación a la acetilcolina en anillos precontraídos con EP. Retire mecánicamente el endotelio frotando suavemente el interior del vaso con un pequeño alambre para inducir la denudación. Luego equilibre los anillos arteriales durante 30 minutos antes del inicio de los experimentos de prueba. Investigue el efecto relajante del extracto de la planta precontrayendo anillos de arteria intrapulmonar con EP. Luego, agregue cuidadosamente de 0.1 a 1000 microgramos por mililitros del extracto de la planta acumulativamente a los anillos intactos del endotelio y los anillos desnudos del endotelio para inducir la vasorelajación y adquirir una curva de respuesta dependiente de la concentración.
Asegúrese de que el DMSO efectivo utilizado como solvente también se evalúe de manera similar para servir como control negativo. Evaluar el mecanismo de acción vasorelajante del extracto de la planta como se menciona en el texto manuscrito. Luego, después de que las contracciones a PE se estabilicen, agregue concentraciones acumulativas del extracto de la planta.
Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos de la arteria intrapulmonar en presencia de inhibidores en comparación con la respuesta de los anillos de la arteria intrapulmonar sin inhibidores y construir la curva de respuesta a la concentración. En la arteria intrapulmonar intacta del endotelio, el extracto de la planta provocó una respuesta de vasorelajación dependiente de la concentración. La erradicación del endotelio redujo profundamente la vasorelajación inducida por el extracto de la planta como se refleja en el aumento de la CE50 en 2,2 veces, la inhibición de eNOS y EDHF evidentemente disminuyó la respuesta vasorelajante al extracto de la planta.
Esto desplazó la curva de respuesta de concentración hacia la derecha y aumentó el EC50 sin alterar los valores de E max. Por el contrario, la indometacina no mostró ningún efecto sobre la respuesta vasorelajante al extracto de la planta. En los anillos de la arteria intrapulmonar desnudos por endotelio, los bloqueadores de los canales de potasio activados por calcio disminuyeron la respuesta vasorelajante al extracto de la planta.
Mientras que los bloqueadores de los canales de potasio dependientes de voltaje o sensibles al ATP no mostraron desviación. La preincubación con el extracto de la planta inhibió la contracción inducida por cloruro de calcio. Los anillos de las arterias intrapulmonares desnudos de endotelio preincubados con solución de Krebs sin calcio y EP produjeron una contracción transitoria.
En comparación con el vehículo, los extractos de plantas redujeron significativamente la contracción inducida por la EP. Durante el procedimiento, uno debe identificar claramente la vena, los bronquios y la arteria desde el principio. Cortar o dañar la arteria reducirá su longitud y afectará las respuestas vasculares. Esta técnica se puede adaptar para investigar compuestos que puedan servir como prototipos para tratamientos de enfermedades vasculares pulmonares como la hipertensión arterial pulmonar.
