Este trabajo fue apoyado por fondos de la American Heart Association (AM), el Departamento de Defensa de Estados Unidos (BC074986) y del Hospital Infantil de Boston Facultad beca Desarrollo Profesional (TM, AM). Los autores agradecen a Amanda Jiang y Jiang Elisabeth para la asistencia técnica.

NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles. 1. Preparación del gel de fibrina <ol><li> Preparar gel de fibrina que contiene VEGF y bFGF. <ol><li> Descongelar las soluciones madre de fibrinógeno y trombina que se almacenan a -80 ° C hasta la temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Añadir la trombina (concentración final: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentración final: 45 mM), VEGF (concentración final: 0-100 ng / ml) y bFGF (concentración final: 0-100 ng / ml) a la fibrinógeno solución (concentración final: 12,5 mg / ml en 0,9% sodium solución de cloruro 43-45) en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Mezclar suavemente con la pipeta. </li><li> Pipetear suavemente 200 l de la mezcla en un plato de plástico estéril de una forma gota a gota utilizando puntas de pipeta p200. </li><li> Incubar las gotas a 37 ° C durante 30-60 minutos hasta que se solidifican. NOTA: El gel solidificado se puede mantener en el plato de plástico sellada a temperatura ambiente (25 ° C) durante varias horas antes de la implantación (Figura 1a). </li></ol></li><li> Recorte el gel de fibrina en aproximadamente 3 x 3 x 3 cubos mm utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas antes de la implantación. </li></ol> 2. Preparación del ratón <ol><li> Anestesie ratón adulto (8-12 semanas) mediante inyección intraperitoneal (IP) de inyección de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) y confirmar que el ratón se anestesia adecuadamente por pellizcos del dedo del pie del ratón. <ol><li> Use ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad durante el experimento. </li></ol></li><li> Fu Shaver sobre el lado izquierdo de la caja torácica del ratón. </li><li> Realizar intubación endotraqueal del ratón. </li><li> Coloque el ratón en la intubación de pie en ángulo de 70 ° y mantenga pulsado el ratón en lugar enganchando sus incisivos superiores sobre una banda pequeña de goma situado en la parte superior del soporte. </li><li> Retraer la lengua suavemente a un lado el uso de fórceps romos. </li><li> Visualizar la laringe con la ayuda de un microscopio de cuello de cisne iluminador de fibra óptica. </li><li> Insertar catéter endotraqueal elástico (21 G) en la tráquea. </li><li> Confirme que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial). </li><li> Coloca el ratón en posición prona con el microscopio de disección. </li><li> Mecánicamente ventilar el ratón usando un ventilador de roedores (150 respiraciones / min y 7 ml / kg de volumen corriente). </li><li> Cuente costillas para localizar el espacio intercostal entre el 4 y 5 de la costilla. </li><li> Crear un campo estéril sobre el área by limpiar a fondo con alcohol y povidona-yodo. Cubra el campo quirúrgico adecuadamente con un paño quirúrgico estéril. </li></ol> 3. Ratón Cirugía <ol><li> Después de la inyección local de bupivacaína al 0,25% (200 l) en la piel, hacer una incisión en la piel transversal (aproximadamente 1 cm de longitud) sobre el espacio intercostal usando tijeras de disección. </li><li> Después de la inyección de bupivacaína al 0,25% (200 l) en el músculo intercostal, hacer una incisión músculo entre el 4 ° y 5 ° costilla utilizando finas tijeras pequeñas. </li><li> Insertar un retractor de disección entre las costillas para visualizar completamente el pulmón izquierdo. <ol><li> Raspe un área pequeña (1 x 1 mm cuadrado) de la pleura visceral del centro del pulmón izquierdo utilizando unas pinzas finas. </li><li> Aplique una leve presión sobre el área con un hisopo de algodón estéril hasta que el sangrado y fugas de aire están completamente controlados. </li><li> Ponga una pequeña cantidad de mezcla fresca de fibrinógeno / trombina (cola de fibrina) (paso 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sobre la zona usando punta de la pipeta p200. </li></ol></li><li> Con cuidado, coloque un gel de fibrina (paso 1.2) usando unas pequeñas pinzas sobre el área (Figura 1b). <ol><li> Confirmar que el gel está bien fijada en la zona durante los movimientos respiratorios del pulmón. </li></ol></li><li> Asegúrese de que no hay ni fugas de aire masiva ni hemorragia del pulmón. </li><li> Cerrar incisiones (capas musculares y de la piel) con sutura absorbible, que no tienen que ser eliminados. </li><li> Aspirar la cavidad torácica usando 27 G aguja y jeringa de 1 ml para prevenir el neumotórax. </li><li> Terminar la ventilación mecánica. </li></ol> 4. Recuperación Ratón <ol><li> Asegúrese de que el ratón está respirando espontáneamente de una manera suave (regular 100-150 respiraciones / min, sin respiración paradójica o superficial). </li><li> IP inyectar 1 ml de pre-calentado 0,9% de NaCl para evitar la deshidratación. </li><li> Deje que el ratón para recuperar en la plataforma de agua caliente que circula. </li><li> Retire la endotracheal tubo después de confirmar que el ratón tiene respiración estable. </li><li> Inyectar Meloxicam (5 mg / kg, inyección subcutánea (SC), durante 3 días como analgésico postoperatorio. </li><li> Vigilar los movimientos del ratón cuidadosamente en un mínimo de intervalos de 15 min hasta que es esternal (capaz de rodar sobre su estómago y permanecen en posición vertical) y consciente. </li><li> Después de la recuperación, devuelva el ratón a una nueva jaula aislada de ratones sin necesidad de cirugía. </li><li> Supervisar el sitio quirúrgico para detectar signos de infección (enrojecimiento, inflamación, secreción), funciones biológicas básicas de animales (alimentos y la ingesta de agua, micción, defecación, aumento de peso corporal), así como los signos clínicos de dificultad (piloerección, locomoción reducida) al día siguiente a la procedimiento quirúrgico. </li></ol> 5. La recolección del pulmón <ol><li> 7 a 30 días después de la implantación, la eutanasia el ratón usando CO 2 a través de fuente de gas comprimido. </li><li> Hacer una incisión entre la punta del apéndice xifoides y el esternónmuesca (esternotomía mediana) y toda la cosecha de pulmón con el gel implantado para el análisis histológico y bioquímico mediante la reducción de la tráquea y la disección de todas las conexiones al corazón, los pulmones y la tráquea. </li><li> Fijar gel implantado con pulmón con una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ºC, incrustar en compuesto OCT, y tomar las secciones de paso de serie de 30 micras de espesor. </li><li> Realizar histológico (hematoxilina y eosina) y los análisis inmunohistoquímicos (marcador endotelial: CD31, marcador epitelial: proteínas acuaporina (AQP) 5 y surfactante (SP) -B) usando el microscopio confocal 22,37,40. </li><li> Compilar pilas de secciones ópticas (30 m de espesor) para formar imágenes tridimensionales de endotelial de pulmón y las células epiteliales de la imagen 3D utilizando el software de análisis 37. </li><li> Cuantificar áreas proyectadas de los vasos sanguíneos de nueva formación con software de análisis 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de 50...

El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares. Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de larga duración crónicas respiratorias como dificultad para respirar, opresión en el pecho, tos persistente y cansancio, que deterioran significativamente su vida diaria 1-3. A pesar de una gran cantidad de esfuerzo para desarrollar terapias eficaces para estas enfermedades de los pulmones, en la actualidad no existe una cura; Por lo tanto, la calidad de vida de estos pacientes es pobre y económica y los costos humanos son high 4-7. En la actualidad, el trasplante de pulmón es la única manera de salvar a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas en fase terminal. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de trasplante, de alto costo, complicaciones graves, y la baja tasa de supervivencia 8-11, el trasplante no es un enfoque óptimo. Rápidos progresos recientes en las técnicas de ingeniería de tejidos ha permitido a los investigadores bioingeniería pulmón implantable por repoblar descelularizado pulmonar completo con varios tipos de células progenitoras o células madre pluripotentes inducidas (iPS) células 12,13. Sin embargo, estos pulmones bioingeniería son funcionales en animales huéspedes sólo durante varias horas después 12,14,15 implantación. Utilizando biomateriales para regenerar las complejas estructuras y funciones de los pulmones ha sido también bastante éxito. Esto puede deberse a que los procesos biológicos fundamentales que rigen la regeneración pulmonar de adultos no han sido bien explorado. En el pulmón, la formación del sistema vascular es uno de los acontecimientos más tempranos y más importantes duriel desarrollo y la regeneración 16-21 ng. Vasculaturas recién formado en el pulmón no sólo entregar oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares necesarios para la formación de órganos, sino que también proporcionan señales reguladoras instructivos a las células circundantes 22-25. Por lo tanto, la angiogénesis juega un papel clave en alveolarization regenerativa en pulmones adultos 24,26,27. Además, la angiogénesis desregulada contribuye a enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) 28, la displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, y fibrosis pulmonar 29. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la ingeniería de los pulmones o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas, es necesario comprender los mecanismos fundamentales de la angiogénesis pulmonar específica. Cada órgano muestra las propiedades mecánicas y químicas únicas, que pueden diferir entre las condiciones fisiológicas y patológicas 30-33. Estos microenviron órgano-específicamentos regulan los comportamientos de las células endoteliales y orquestan formación de la red vascular de una manera específica de órgano 24,34-36. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la regeneración de pulmón, el mecanismo subyacente a la angiogénesis pulmonar específica necesita ser entendido. Mientras ensayos de angiogénesis in vivo convencionales tales como la implantación subcutánea de hidrogel se han utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis 37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Recientemente, un nuevo método para implantar Matrigel en un molde elástico en el pulmón de ratón ha sido desarrollado y demostrado con éxito para reclutar vasos sanguíneos y células epiteliales del pulmón en los geles 22. Este enfoque único permitirá a los investigadores explorar el mecanismo de la angiogénesis-pulmón específico, así como las interacciones entre los vasos sanguíneos y las células pulmonares no vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas. Desde 1) Matrigel no es adecuado para la aplicación clínica; 2) el correomolde lastic utilizado para lanzar el gel puede afectar a las interacciones entre los hidrogeles y tejido pulmonar anfitrión y 3) el molde elástico en el pulmón potencialmente causa un deterioro de la función pulmonar y el dolor durante la respiración, como un enfoque más clínicamente relevante, una matriz de fibrina 3D que contiene factores angiogénicos (factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) ha sido implantado en el pulmón de ratón sin poner en el molde elástico, y se ha recapitulado éxito anfitrión angiogénesis pulmonar derivados. Gel de fibrina, fibrillas de polímeros generados a partir de fibrinógeno escindido por trombina, es conocido para atrapar una variedad de factores angiogénicos como bFGF y VEGF para acelerar la angiogénesis in vivo 40,41. Debido a su capacidad regenerativa y la naturaleza biodegradable 42, gel de fibrina se utiliza ampliamente en el campo de la ingeniería de tejidos. Este artículo presenta un enfoque novedoso y único para implante de gel de fibrina en la superficie pulmonar de adult vivirt ratón y demuestra que anfitrión angiogénesis pulmonar derivado se recapitula el interior de los geles en vivo. Este método, que permite a los investigadores estudiar la angiogénesis pulmonar específica, es probable que conduzca al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares y avanzar significativamente los esfuerzos para regenerar con éxito pulmón adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel - mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.

Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a....

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K vistas.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Investigación

Medicina

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...