Debido a que los organoides recapitulan la organización estructural nativa, así como muchas características moleculares del epitelio intestinal in vivo, esta técnica nos permite estudiar la biología normal y los estados de la enfermedad en el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de diseñar genéticamente organoides utilizando un enfoque de transducción muy altamente eficiente con baja citotoxicidad, lo que permite estudios funcionales de estos organoides manipulados genéticamente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para la enfermedad intestinal porque podemos exponer organoides intestinales a fármacos y otros agentes o intervenciones.
Este método se puede aplicar para estudiar procesos patéticos y de desarrollo en otros sistemas susceptibles de cultivos organoides, como los tejidos mamarios o para las células que crecen bajo condiciones 2D estándar. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán éxito con la transducción en organoides difíciles de ingenieros u otras células. Primero tuvimos la idea de este método cuando nos encontramos con dificultades para transducir nuestros organoides y células madre.
La demostración visual de este método es crítica, ya que la pérdida estructural de los organoides puede ocurrir si las muestras no se tratan adecuadamente durante el proceso de incrustación en la matriz del sótano para la criosectación. Para cultivar organoides para la transducción viral, los cultivos celulares organoides de semillas con 200 microlitros de medios de transducción por pozo en una placa de 48 pozos, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar. Descongelar viales de virus para la transducción, permitiendo alrededor de 50 microlitros de virus concentrados para la transducción de cada pozo en placas de 48 pozos.
En un tubo de 1,5 mililitros, mezcle el virus con 12 microlitros de una solución de nanopartícula magnética e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue la solución de nanopartículas magnéticas y la mezcla de virus a las células a transducir. Coloque la placa de 48 pozos en una placa magnética e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante al menos dos horas.
Cuando la transfección viral esté completa, transfiera los racimos de células organoides infectadas y el medio de transducción de cada pozo a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante con succión suave y enfríe los tubos que contienen el pellet sobre hielo durante cinco minutos.
Añadir 120 microlitros de matriz de membrana sótano a cada tubo, y resuspender el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Siembra de 30 microlitros de la mezcla matriz-célula en una nueva placa de 48 pozos. Incubar la placa a 37 grados celsius durante cinco a 15 minutos hasta que la matriz se solidifique.
Añadir medio de transducción a cada pozo, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante tres a cuatro días. Después de tres a cuatro días, inspeccione los cultivos bajo un microscopio de luz con un aumento de 10 veces para asegurar la organización de los racimos celulares en estructuras organoides. Sustituya suavemente el medio de transducción en cada pozo por 250 microlitros de medio de cultivo organoide ENR.
Devuelva la placa a la incubadora. Comience este procedimiento retirando el medio ENR por succión suave, teniendo cuidado de no perturbar la matriz de membrana del sótano. Lavar suavemente con 500 microlitros de PBS.
Fijar los organoides añadiendo un microlitro de 4%solución de paraformaldehído por pozo, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la solución de paraformaldehído por succión. Agregue suavemente un microlitros de PBS por pozo, y luego retire el PBS por succión suave.
De esta manera, lave dos veces con PBS. Retire el PBS del segundo lavado y agregue un microlitros de 30% de tampón de sacarosa a cada muestra. Incubar los organoides fijos en sacarosa durante una hora a cuatro grados centígrados para deshidratar las muestras.
Retire el búfer de sacarosa por succión, y agregue suficiente compuesto de incrustación para cubrir la capa de matriz en cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras en un congelador celsius de menos 80 grados durante 10 minutos o hasta que el compuesto de incrustación se vuelva sólido y blanco.
Coloque la placa con compuesto de incrustación congelado a temperatura ambiente para permitir una fusión mínima del compuesto a lo largo de los bordes. Usa un bisturí o una espátula para separar el bloque de las paredes del pozo. Trabaje rápidamente para evitar el derretimiento, utilizando fórceps para eliminar el bloque compuesto de incrustación de matriz, y colóquelo en un bloque de muestras.
Llene el molde completamente con compuesto de incrustación. Congele a menos 80 grados Centígrados durante 30 minutos antes de usar el bloque para seccionar. Este protocolo se optimizó transduciendo primero organoides intestinales con vectores lentivirales vinculados a la GFP.
La GFP se visualizó en cada etapa del desarrollo organoides, incluso al principio cuando las células de la cripta se organizan en estructuras similares a quistes o en momentos posteriores cuando los organoides forman brotes. Los organoides intestinales transducidos con éxito fueron entonces fijados por formalina, criocoscionados y analizados por imágenes de inmunofluorescencia. En esta imagen, los núcleos se tiñen de azul, y el verde indica moléculas de adhesión de células epiteliales, que demarcan los bordes celulares.
El rojo indica manchas de lisosoma para identificar las celdas de Paneth. Una vez dominados, los organoides transductores se pueden realizar en unas tres horas, y la incrustación de la criosectación de organoides se puede hacer en aproximadamente 2 horas y media. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en hielo al manipular reactivos de matriz de sótano.
Después de completar este procedimiento, se pueden realizar análisis inmunofluorescentes y otros métodos para detectar proteínas u orgánulos para evaluar la localización o la abundancia relativa. Esta técnica allana las formas para que los investigadores exploren la biología normal y los estados de la enfermedad in vitro y también para estudios in vivo si los organoides o células transducidas se pueden implantar en ratones. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar virus etiquetados magnéticamente para diseñar genéticamente organoides para la criocciones.
Por favor, no olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección adecuado al realizar este procedimiento.
