Los organoides tumorales se han utilizado ampliamente como un modelo de cáncer in vitro para estudiar la biología tumoral. Nuestro protocolo proporciona un procedimiento detallado para aislar, cultivar y manipular genéticamente los organoides del tumor de vejiga que sirven como una herramienta crítica para estudiar diversos aspectos en la biología del cáncer. Usando nuestro protocolo, podemos manipular genéticamente los organoides del tumor de la vejiga para expresar o eliminar el gen de nuestro interés.
Además, con nuestro método de trasplante ortotópico, podemos crear un tumor intacto microambiente organoides tumorales. Demostrando el procedimiento estará Yubin Kim, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Comience por establecer organoides del tumor de vejiga a partir del tumor de la vejiga murina.
Añadir un mililitro de 10 HEPES mililolares en DMEM a los fragmentos tumorales y picar el tejido con una cuchilla de afeitar esterilizada. Para disociar los fragmentos en la suspensión celular, añadir nueve mililitros de DMEM con HEPES, colagenasa tipo uno y dos, y termolsina a las piezas del tumor, y incubarlos durante 1,5 a dos horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono en un agitador orbital. Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros.
Centrifugar el tubo a 400 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón de la lesión ACK e incubar el tubo a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos para anlicer los glóbulos rojos. Mientras tanto, cubra un pozo en una placa de 24 pozos con 150 microlitros de factor de crecimiento frío helado redujeron la matriz de membrana del sótano y coloque la placa en una incubadora durante 30 minutos.
Añadir 20 mililitros de DMEM en el tubo con las células y repetir la centrifugación. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de 0.25%trypsin EDTA y 10 micromolares Y-27632 dihidrocloruro. Incubar el tubo durante cinco minutos en un baño de agua de 37 grados Centígrados.
A continuación, neutralice la tripina añadiendo 10 mililitros de DMEM con 10%FBS. Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 100 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros para eliminar los desechos no digeridos. Centrifugar el tubo a 400 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante.
Luego resuspender el pellet con un mililitro de DMEM y contar las células con un hemocitometro. Transfiera de tres a cuatro veces 10 a las cuatro células tumorales a un microtubo de 1,5 mililitros sobre hielo y centrifugarlo a 400 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspendir las células en 500 microlitros de medio organoide preadide y 10 micromolares Y-27632.
Transfiera la suspensión celular a la matriz de membrana previamente preparada recubierta bien y coloque la placa de 24 pozos de nuevo en la incubadora. Sustituya el medio cada dos días por 500 microlitros de organoide preadnciado. Divida los organoides tumorales 12 horas antes de la transducción mediada por Lentivirus.
Al día siguiente, descongela rápidamente un virus que contiene alícuota en un baño de agua Celsius de 37 grados. Añadir el virus descongelado a 250 microlitros de organoide medio con 10 micromolares Y-27632 y ocho microgramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina. Sustituya el medio organoide de la placa de 24 pozos por 500 microlitros del virus que contiene el medio e incubar la placa durante 12 a 16 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para preparar los organoides del tumor de vejiga para el trasplante ortotópico, agregue 500 microlitros de collagenasa dispase al medio organoide en la placa de 24 pozos. Pipetear la matriz de membrana del sótano y el medio hacia arriba y hacia abajo y luego incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, recoger las células en un tubo de 15 mililitros y añadir cinco mililitros de DMEM preadmanido.
A continuación, centrifugar el tubo a 400 veces g durante tres minutos a cuatro grados Centígrados y aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet con un mililitro de DMEM y transferir la solución a un plato Petri de 90 milímetros. Bajo un microscopio, recoge de 10 a 100 organoides tumorales con una pipeta P200 y recógelos en un microtubo sobre hielo.
Centrifugar el microtubo y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego mantenga el pellet sobre hielo hasta que los ratones estén listos para la cirugía. Antes del trasplante submucoso de la pared de la vejiga, mantenga las jeringas, las puntas de pipeta y la matriz de membrana del sótano sobre hielo hasta que estén listas para usar.
Después de que el ratón ha sido anestesiado, colocarlo en una posición supina y mantener la anestesia por inhalación de mascarilla de isoflurano vaporizado 2%. Aplicar yodo de povidona con una gasa estéril y limpiarlo con 70%etanol. Haga una pequeña incisión transversal en la piel y la pared muscular del abdomen de la línea media inferior con tijeras quirúrgicas estériles.
Exponga la vejiga de la cavidad abdominal y apóyela con un hisopo de algodón empapado en solución salina. Resuspender los gránulos organoides en 80 microlitros de medio organoide que contienen matriz de membrana sótano de alta concentración al 50% e inyectar la suspensión en el aspecto anterior de la cúpula de la vejiga utilizando la jeringa de insulina. Cierre la incisión con una sutura de nylon 4-0 y desinfecte el sitio quirúrgico con yodo povidona y 70%etanol.
Permita que el ratón se recupere bajo un irradiador infrarrojo durante 10 a 15 minutos. Luego monitorea el ratón de nuevo hasta que recupere la conciencia. Los organoides tumorales de la vejiga de ratón se establecieron y cultivaron durante nueve días.
Si las células tumorales no forman organoides tumorales, potencialmente se mataron durante el paso de disociación y es posible que sea necesario ajustar el tiempo de digestión enzimática. Los organoides del tumor de la vejiga mostraron señales de GFP fuertes con infección lentiviral exitosa. Después de la concentración, un total de 250 microlitros de virus que contienen medios fueron suficientes para infectar 30.000 células tumorales individuales en la matriz de membrana del sótano y mantener una eficiencia de infección de 90 a 100%.
Los alógrafos de tumores de vejiga se cosecharon tres semanas después del trasplante ortotópico y se analizó la histología del tumor mediante tinción de H&E. Los trasplantes ortotópicos de organoides tumorales pueden crecer como tumores de vejiga durante dos a tres semanas. Después de este procedimiento, los investigadores pueden realizar inmunohistoquímica de organoides tumorales resultantes o llevar a cabo un RT-PCR cuantitativo para genes de interés.
Estos experimentos pueden caracterizar aún más los organoides tumorales. Nuestro protocolo nos permite manipular los genes de las células cancerosas fácilmente en comparación con el modelo de ratón manteniendo las características in vivo de los tumores con el fin de estudiar las funciones específicas de diversos genes implicados en la tumorigenesis del cáncer de vejiga.
