Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la leucemia linfocítica crónica, como el pronóstico preciso de los pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que es simple, rápida y altamente precisa. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia un pronóstico robusto, sobre todo certificaciones de riesgo con pacientes con leucemia linfocítica crónica porque el pronóstico preciso puede definir más adelante el manejo terapéutico de la enfermedad.
La demostración visual de este método es crítica, como la selección de productos PCR y los tipos de análisis de secuencia de resumen son difíciles de aprender porque requieren precisión y experiencia. Para comenzar este procedimiento, añada 200 microlitros de EDTA a un tubo de recogida estéril de 50 mililitros. Añadir 20 mililitros de sangre periférica y 15 mililitros de RPMI medio al tubo y pipeta arriba y abajo dos o tres veces para mezclar.
A continuación, añada 15 mililitros de medio de gradiente de densidad a un nuevo tubo de recogida de 50 mililitros. Capa lenta de la solución de sangre periférica en el medio de gradiente de densidad, asegurándose de que no interrumpa el gradiente. Centrifugar a 800 veces G durante 20 minutos con el freno centrífugo apagado.
A continuación, utilice una pipeta Pasteur estéril para recoger el anillo celular mononuclear que se ha formado entre la capa plaquetaria plasmática superior y la capa media de gradiente de densidad y transfiérelo a un nuevo tubo de recolección estéril de 15 mililitros. Añadir el medio RPMI de tal manera que el volumen final sea de 12 mililitros y pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Centrifugar a 800 veces G durante ocho minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de medio RPMI. Centrifugar de nuevo a 750 veces G durante ocho minutos. Después de esto, deseche el sobrenadante y disuelva el pellet celular en un mililitro de PBS.
Usando una nueva placa Bauer, forme un recuento de células mezclando 20 microlitros de muestra y 80 microlitros de una a 10 solución de turco. Si el procesamiento posterior de la muestra no está programado para el mismo día, centrifuga la muestra a 750 veces G durante ocho minutos. Deseche el sobrenadante y almacene el pellet celular a menos 80 grados Centígrados.
En primer lugar, prepare la mezcla de imprimación utilizando cantidades equimolares de cada imprimación de subgrupo para asegurar una amplificación imparcial. Mezcle los reactivos PCR como se indica en la tabla dos del protocolo de texto. Añadir 0,5 microlitros de TAP polimerasa al tubo PCR que contiene los reactivos pcR mixtos.
A continuación, agregue 100 nanogramos de gDNA o dos microlitros de ADNr. Ejecute el protocolo de PCR térmico como se detalla en la tabla tres del protocolo de texto. Después de esto, compruebe si hay productos de PCR de aproximadamente 500 pares de bases cuando utilice imprimaciones de litro IGHV o 350 pares base cuando utilice las mezclas de imprimación IGHPFR1.
Para comenzar la purificación del producto PCR, cargue el volumen total del producto PCR en un gel de agarosa de baja fusión por ciento. Permita que los productos PCR se ejecuten en el gel hasta que se separen del fondo. Exémete de las bandas de PCR prominentes y luego purificarlas y elearlas.
Si se detectan dos reordenamientos, ambas bandas deben extirparse y secuenciarse por separado. Para realizar la limpieza de exo-sap, siga las instrucciones del fabricante con respecto a los volúmenes específicos a utilizar. Atrafirque suavemente cada muestra para mezclarlas e incubarlas en un bloque de PCR a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Inactivar las enzimas calentándolas a 85 grados Celsius durante 15 minutos. Después de esto, cargar una pequeña cantidad de los productos de PCR en un gel de agarosa del tres por ciento para evaluar la pureza del producto. El último punto de control antes de la secuenciación es determinar la clonalidad de la muestra mediante el análisis de fragmentos.
Para comenzar a analizar la secuencia, inicie el software adecuado. Especifique la especie, como homo sapiens, y el tipo de receptor o locus. Pase el ritmo de las secuencias que se analizarán en formato fasta e incluya identificadores en el área de texto en lotes de hasta 50 secuencias por ejecución.
A continuación, elija una de las tres opciones de visualización siguientes para los resultados. Vista detallada: elija esta opción para obtener los resultados de cada secuencia individualmente. Vista de síntesis:elija esta opción para compilar una tabla de resumen ordenada por el gen IGHV y el nombre del alelo o por orden de entrada de secuencia.
Esta opción también proporciona una alineación de secuencias que en cualquier lote enviado se asignan al mismo gen IGHV y alelo y, por último, al archivo de Excel. Elija esta opción para proporcionar todos los archivos de salida como hojas de cálculo incorporadas en un solo archivo. Sólo el uso de imprimaciones de litro IGHV permite la amplificación de toda la longitud del IGHV reorganizado, lo que permite determinar la verdadera carga HSM.
El producto PCR esperado es de aproximadamente 500 pares base. En raras ocasiones en los que las imprimaciones de litro IGHV no pueden amplificar el reordenamiento clonotípico IG, se pueden utilizar imprimaciones IGHBFR1. El producto PCR esperado es de aproximadamente 350 pares base.
Las secuencias obtenidas se analizan utilizando la herramienta IMG TV Quest. La primera fila de la tabla de resultados indica la funcionalidad de la secuencia, ya que una secuencia reorganizada por IG puede ser productiva o improductiva. Un reordenamiento del gen IGH es improductivo es detener los codones están presentes dentro de la región VDJ y/o si la reorganización está fuera de la trama debido a inserciones/eliminaciones.
Es importante tener en cuenta que sólo los reordenamientos productivos y por lo tanto funcionales deben analizarse más a fondo. Cuando se utilizan los parámetros predeterminados de IMG TV Quest, las inserciones y eliminaciones no se detectan automáticamente, sin embargo las indicaciones seguras de que una secuencia puede llevar tales alteraciones son proporcionadas por la herramienta y una alerta de advertencia aparece debajo de la tabla de resumen de resultados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aterrizar los productos PCR en el gel el tiempo suficiente para que el enlace clonal pueda ser discriminado desde el fondo policlonal.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunogenética de la leucemia linfocítica crónica exploraran el impacto pronóstico del estado de epimutación somática en los pacientes. No olvide que trabajar con bromuro de etilelio puede ser extremadamente peligroso y precauciones como trabajar bajo el capó en todo momento siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
