Agradecemos a la Sra. LourdesCarreon G Tan por su ayuda en el mantenimiento de las instalaciones de medaka y Anthony Peltier para las Figuras ilustrativas. Este trabajo fue financiado por NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, números de concesión 244461 (programa de acuicultura) y 248828 (programa de Noruega vida Digital).

Manejo de los animales se realizan según las recomendaciones para el cuidado y bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y bajo la supervisión de investigadores autorizados.
1. preparación de instrumentos y soluciones
Nota: Todas las soluciones deben ser estériles. Debe prestarse atención cuidadosa para el pH y la osmolalidad (osmol/kg agua) de todas las soluciones, que debe ser cuidadosamente adaptada al ambiente extracelular de las especies estudiadas. pH y la osmolalidad deben ajustarse con precisión equipos electrónicos tales como medidor de pH y punto de congelación osmómetro respectivamente.
<ol><li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular sin Ca2 + (Ca2 + CE libre): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, de 5 mM glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, a 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de alta pureza (0,055 uS / cm a 25 ° C, la resistividad de 18,2 megaohmios) H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular (EC): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 500 mL de la solución extracelular con 0,1% de seroalbúmina bovina (CE-BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glucosa de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Disolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glucosa y 1,19 g de HEPES en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7.75 con NaOH.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 290-300 mOsm con manitol. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm. Agregar 50 mg de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tomar 250 mL de solución intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarosa 20 mM.
	<ol>
<li>Disolver 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES y 1,712 g de sacarosa en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
		<li>Ajustar el pH a 7,2 con ácido sulfónico de (MES) (N-morfolino) etano.</li>
		<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 250 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 250 mL.</li>
		<li>Mezclar la solución antes de medir la osmolalidad. Ajuste a 280-290 mOsm (10 mOsm inferior CE) con sacarosa. Filtro de esterilizar la solución mediante sistema de vacío de agua y filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer 100 mL de solución de agarosa de fusión baja de 2% de BSA libre CE y Ca2 + (2 g de agarosa baja fusión en 100 mL de Ca2 + libre CE). Disolver usando el microondas y colocar la agarosa fundida en un baño de agua a 40 ° C. Deje que se enfríe hasta 40 ° C antes de su uso en los tejidos. Nota: EC, Ca2 + CE libre puede ser almacenada a 4 ° C durante varias semanas si estériles y soluciones IC a-20 ° C, durante varios meses. Agarosa se puede conservar durante una semana a 4 ° C y puede ser reutilizada 3 a 5 veces por microondas brevemente. Reutilización excesiva dará lugar a la evaporación y la alteración de la agarosa y la concentración de la sal y la calidad.</li>
	<li>
Hacen puente de agar:
	<ol>
<li>Calor de Capillares de vidrio de borosilicato largo de 7,5 mm con diámetro exterior (D.E.) de 2 mm y diámetro (I.D.) 1,16 mm utilizando un mechero Bunsen en un focal interior punto aproximadamente 1/3 de un extremo hasta que el cristal comienza a doblar. Retire el vaso de la llama y deje que el vidrio doblar con un ángulo de 120 grados (figura 2A).</li>
		<li>Derretir 2% agar en CE normal sin glucosa usando un microondas, y mientras la agarosa es líquido llenar el capilar mediante capilaridad de vidrio hecha de antemano las fuerzas por poner uno de los extremos del vidrio en el líquido y a la espera de algunos minutos. Tienda puentes hasta su uso a 4 ° C en CE sin glucosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar vidrio de borosilicate con pipetas de parche de filamento utilizando un extractor de la pipeta adecuada. Consulte el manual de tirador de la pipeta para obtener la resistencia deseada del electrodo. Nota: La forma cónica de la pipeta debe ser tan corta como sea posible. Forma cónica corta pipeta se logra tirando pasos de 4 – 6. La resistencia del electrodo debe ser entre 2 y 6 MΩ dependiendo del tamaño de la célula.</li>
	<li>
Para evitar el movimiento del tejido durante los experimentos de patch-clamp cubra la superficie de la sala de grabación con 0.1% de polietilenimina (PEI) en solución tampón de borato.
	<ol>
<li>Preparar 500 mL de tampón de borato (25 mM):<ol>
<li>Disolver 4,768 g de Na2B4O710 H2O en 450 mL de ultrapura de H2O en un vaso de vidrio utilizando un agitador magnético.</li>
			<li>Ajustar el pH a 8.4 con HCl.</li>
			<li>Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL. Llene el matraz aforado con ultrapura de H2O hasta 500 mL y 0,2 μm filtro esterilización la solución mediante sistema de vacío de agua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar una solución stock de 1% de PEI (PEI de 50% 1 mL de tampón de borato de 25 mM mL 49) y una dilución de 0,1% PEI diluyendo 10 μl de solución stock de 1% en 100 μl de tampón de borato para uso final.</li>
		<li>Añadir 2 mL de 0.1% de PEI en el cristal del titular del sector y dejar la capa incubar durante 1 minuto. Luego brevemente lavar el vidrio dos veces con 5 mL de la poste-limpieza de H2O y deje secar hasta el uso al aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar soluciones de anfotericina B.
	<ol>
<li>Hacen 60 mg/mL solución stock disolviendo 3 mg de anfotericina B polvo en 50 μl dimetil sulfóxido (DMSO), en un tubo de 1 mL protegido de la luz. Vortex a máxima velocidad durante 30 s y someter a ultrasonidos durante 15 minutos homogeneizar. Guardar alícuotas en tubos de 3 a 5 a-20 ° C y utilizar una alícuota por día. Nota: Si la solución madre de anfotericina B no es claro y amarillo color pero lechoso (amarillo todavía) después de la sonicación de 15 – 20 minutos hace una nueva solución.</li>
		<li>Hacer solución de IC con la anfotericina B pipetear 2 mL de la IC en un vaso limpio de vidrio con más de 10 mL de capacidad. Añadir 8 μl de la solución madre de anfotericina B en la solución de la pipeta y mezclar mediante pipeteo. Envuelva el vaso con papel de aluminio y coloque en hielo hasta su utilización y renovarlo cada 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. disección y corte con Vibratome
<ol><li>Preparar las herramientas de disección antes de disección, incluyendo una fuerte y una pinza fuerte con unas tijeras. Limpiar las herramientas (soporte para papel higiénico, cepillo, pinzas) con etanol y asegúrese de que se utilizan solamente para los propósitos de la disección y nunca en contacto con los tejidos fijos. Guárdalos en una caja separada para evitar la contaminación.</li>
	<li>Eutanasia a los peces de agua fría de hielo durante 1 minuto.</li>
	<li>
Siga los pasos siguientes para disecar rápidamente el medaka cerebro y la hipófisis con pinzas afiladas (uso no más de 3 minutos).
	<ol>
<li>Mientras que sostiene el pescado con el fórceps fuerte severa los dos nervios ópticos detrás de los ojos con unas tijeras o pinzas de sharp.</li>
		<li>Abra la parte dorsal del cráneo desde la parte posterior hacia el anterior rompiendo los huesos del cráneo paso a paso con fuertes pinzas.</li>
		<li>Pele el cráneo por un lado con pinzas fuertes.</li>
		<li>Severa de la médula espinal con tijeras o pinzas afiladas.</li>
		<li>Suavemente, agarrar la médula espinal con el fórceps, voltear el cerebro de posterior a anterior y coloque en un plato con la helada Ca2 + gratis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Llenar un molde de metal de 1,5 – 2 cm3 con agarosa líquida y coloque en el hielo.</li>
	<li>Justo antes de que la agarosa se solidifica (en alrededor de 25 – 30 ° C), suavemente agarra el cerebro por la médula espinal con el fórceps, secar las pinzas con un pedazo de papel fino y poner el tejido en la agarosa. Mezclar rápidamente la agarosa para diluir los rastros de la CE a la izquierda alrededor del tejido y orientar el tejido y dejar el molde en hielo durante unos segundos hasta que la agarosa se endurezca. Nota: Es esencial para este paso a ser rápido. La agarosa se solidifica rápidamente como el molde de metal es enfriado por el hielo.</li>
	<li>Recortar un bloque cuadrado de agarosa que contiene el tejido con una hoja de bisturí y goma en el soporte de espécimen de vibratome con pegamento (no tóxico) de la cirugía.</li>
	<li>Llene la cubeta de vibratome recibiendo las mordazas (cerebro-pituitaria) con helado Ca2 + libre EC.</li>
	<li>Coloque el soporte del espécimen en el vibratome y corte el bloque de agarosa para hacer secciones de parasagittal de 150 μm, usando alta frecuencia y la velocidad baja para el seccionamiento. Recopilar las secciones seleccionadas y colocarlas en la cámara de grabación de patch-clamp con 3 mL de helado Ca2 + gratis CE.</li>
	<li>Coloque el arpa de rejilla (figura 2B) en la sección del tejido. Nota: El arpa junto con la capa estabilizarán el tejido y evitar que se mueva durante las grabaciones de patch-clamp.</li>
	<li>Después de que el arpa está en su lugar, cambie el Ca2 + CE medio libre a la CE normal con Ca2 + y BSA. Deje que el resto de tejido por 10 min.</li>
</ol>3. perforado de Patch-clamp y las grabaciones electrofisiológicas
<ol><li>Antes de comenzar el experimento, de cloruro de plata alambre electrodos por los siguientes pasos: en primer lugar, utilice un papel de lija fino (p180) para limpiar los electrodos de alambre de plata. En segundo lugar, lave con 2 mL, etanol al 70%. En tercer lugar, sumergir los cables en 2 mL, 2 – 5% de cloro durante 10 minutos. Por último, lave con 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>La sala de grabación con la rebanada del cerebro-pituitaria en la platina del microscopio y localizar la zona de destino (pituitaria) con objetivo de 10 X e Inspeccione las células utilizando el objetivo 40 X. Nota: Si la preparación es correcta, muy pocas células redondas deben ser visibles. Estas células redondas son células generalmente dañadas que son desprendimiento del tejido.</li>
	<li>Coloque el electrodo de puesta a tierra a través del puente de agar al 2% en el baño de la EC.</li>
	<li>Localizar una célula sana utilizando el objetivo 40 X. Nota: Una célula sana debe ser firmemente unida a la rodaja de tejido y no redondeada y separada de la rebanada.</li>
	<li>Ajuste el amplificador en tensión-abrazadera (VC; Modo de punto 1 de la Figura 4A ). Abierto el sello prueba ventana y pulse Configuración de la bañera (Figura 4B los puntos 1 y 2. Utilizar un pulso de 5-mV para supervisar pipeta resistencia (punto 3 dela Figura 4B ).</li>
	<li>Rellene la punta de la pipeta de parche con el antimicótica solución gratuita de IC antes de agregar la solución de la IC con la anfotericina B utilizando una jeringa de micro relleno (ver figura 3).</li>
	<li>Añadir una presión ligeramente positiva en la pipeta patch usando jeringa de 1 mL. Nota: Esto hace que un pequeño flujo de líquido de la pipeta de parche que evite la contaminación de la punta.</li>
	<li>Una vez en el baño, evaluar la resistencia de la pipeta de parche y asegúrese de que ninguna partícula se une a la punta de la pipeta (figura 4). Nota: Se adjunta un pequeño trozo de cinta en el monitor mostrando la forma de grabación de vídeo del campo de visión. Esto hace que la colocación de la pipeta del parche en relación con la célula más fácil cuando el objetivo no se centra en la célula.</li>
	<li>Guía de la pipeta del parche hacia la célula utilizando micromanipuladores. Nota: Asegúrese de que la pipeta esté limpia buscando pequeñas partículas que puedan haber conectado a la punta de la pipeta. Cambios bruscos en la resistencia también pueden ser el resultado de partículas en la punta de la pipeta.</li>
	<li>Reajustar la pipeta cuando unos pocos micrones sobre la célula para que la punta de la pipeta toque la celda 1/3 desde el centro de la célula, como se muestra en la figura 5. Al tocar la celda, libere la presión y aplica una succión suave para hacer un sello. Nota: El tiempo de la pipeta de parche entra en el baño a un acertado sello debe ser lo más corto posible. No más de 1 – 1,5 min para evitar llegar a la punta de la pipeta y fugas en el baño de la anfotericina B.</li>
	<li>Inmediatamente cambie a la ventana de parche en el software de patch-clamp (punto 1 de lafigura 4 D ) y tienen un potencial de explotación entre-50 y -60 mV (punto 2 de lafigura 4 ). Cero fuera la capacitancia rápida hecho por la pipeta de vidrio (punto 3 de lafigura 4 ).</li>
	<li>Cambiar a la ventana de la celda en software de patch-clamp (figura 4E los puntos 1 y 2) y comenzar el monitoreo de la resistencia de acceso, Ra, aparece en la ventana. Cero a la capacitancia de la membrana en el software de amplificador (figura 4E punto 3) acceso suficiente. Nota: Acceso suficiente puede tomar de 10 a 30 min (figura 4E punto 2). Un buen acceso para las grabaciones de abrazadera actual debe estar por debajo de 20 M.</li>
	<li>Cambiar a mordaza corriente, IC, en la ventana del software amplificador (figura 4F punto 1). Ajustar las corrientes de rápido-capacitivo en la ventana - abrazadera del software amplificador (figura 4F puntos 2 y 3) con el mismo valor como en 3.12. Comprobar el potencial de la membrana (figura 4F punto 1). Nota: Lo importante es que, si el potencial de membrana es poco profunda (típicos por encima de -35 mV) el celular se ha dañado. Cancelar el registro y encontrar una nueva célula.</li>
	<li>Después de encontrar una célula sana (unida firmemente al tejido con membrana potencial por debajo de -40 mV), comenzar las grabaciones experimentales como se detalla en protocolo 33,34 el fabricante.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar

Las grabaciones electrofisiológicas mediante la técnica de patch-clamp en rebanadas de cerebro-pituitaria requieren cuidadosa optimización. Protocolos bien optimizados para llevar a cabo las investigaciones de células vivas en teleósteos se limitan, con la mayoría de publicaciones utilizando protocolos basados en sistemas mamíferos. En este sentido, es importante ser consciente del hecho de que varios parámetros fisiológicos como pH y la osmolalidad son no sólo las especies dependientes, pero también mucho dep...

La hipófisis es un órgano endocrino clave en vertebrados situados debajo del hipotálamo y posteriores al quiasma óptico. Produce y secreta hormonas de seis a ocho de los tipos celulares específicos. Hormonas hipofisarias constituyen un intermedio entre el cerebro y los órganos periféricos y manejar una amplia gama de procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el crecimiento, la reproducción y la regulación de la homeostasis. Similar a las neuronas, las células endocrinas de la hipófisis son eléctricamente excitables con capacidad para disparar potenciales de acción espontáneamente 1. El papel de estos potenciales de acción es dependiente de la célula. En varios tipos celulares de la hipófisis mamífero, potenciales de acción pueden elevar el Ca intracelular2 + suficientemente para una liberación sostenida de hormonas 2. Además, la hipófisis recibe información tanto estimulante como inhibitoria en el cerebro que afecta el potencial de membrana de las células 3,4,5,6. Por lo general, entrada estimulante aumenta la excitabilidad y a menudo implica la liberación de Ca2 + de los almacenes intracelulares así como mayor frecuencia 7de disparo. Entendimiento de cómo la célula utiliza la composición de la canal de ion y se adapta a estas señales de entrada en el cerebro es clave para la síntesis de la hormona de comprensión y liberación.
La técnica de patch-clamp fue desarrollada a finales de 1970 por Sakmann y Neher 8,9,10 y mejorada por Hamill 11y permite investigaciones detalladas de las propiedades electrofisiológicas de las células hasta canales de iones individuales. Por otra parte, la técnica puede utilizarse para el estudio de corriente y voltaje. Hoy en día, parche-es el estándar de oro para la medición de las propiedades electrofisiológicas de la célula. Cuatro configuraciones principales de la técnica de patch-clamp de cierre hermético han sido desarrollado 11; la célula adjunta, dentro, la exterior y el parche de células completas. Las tres primeras configuraciones se utilizan típicamente para las investigaciones de canal de iones individuales. Para el cuarto, después de la configuración de conexión de celda, un agujero en la membrana celular se realiza mediante presión sub-atmosférica. Esta configuración también permite que las investigaciones de la composición de la canal de ion de la célula entera 12. Sin embargo, una limitación de esta técnica es que moléculas citoplásmicas se diluyen por el parche pipeta solución 13 (figura 1A), pues afecta las respuestas eléctricas y fisiológicas de las células estudiadas. De hecho, algunas de esas moléculas pueden jugar papeles importantes en la transducción de la señal o en la regulación de canales iónicos diferentes. Para evitar esto, Lindau y Fernandez 14 desarrolló un método donde se agrega un compuesto formando poros a la pipeta del parche. Tras la configuración de conexión de celular, el compuesto se incorporan en la membrana de plasma bajo el parche y lentamente perfore la membrana creando contacto eléctrico con el citosol (figura 1B). Pueden utilizar varios diferentes antifúngicos como la nistatina y la anfotericina B 15 16o surfactantes como la saponina beta-escina 17,18 . Estos compuestos crean poros lo suficientemente grandes como para permitir que los cationes monovalentes y Cl– difusión entre el citosol y la pipeta patch conservando los niveles citosólicas de macromoléculas y los iones más grandes como Ca2 + 15, 16.
El reto de usar parche perforado es la resistencia serie potencialmente alto. Resistencia en serie (Rs) o acceso de resistencia es la resistencia combinada sobre la pipeta patch concerniente a la tierra. Durante las grabaciones de la abrazadera del remiendo, Rs estará en paralelo con la resistencia de la membrana (Rm). Rm y Rs en trabajo paralelo como un divisor de tensión. Con la alta Rs, la tensión caerá sobre la Rs dando errores en las grabaciones. El error será mayor con las corrientes más grandes registradas. Además, el divisor del voltaje también es frecuencia dependiente creando un filtro de paso bajo, afectando así a la resolución temporal. En efecto, el parche perforado no siempre permiten grabaciones de grandes y rápidas corrientes como el voltaje bloqueado las corrientes Na+ (para lecturas detalladas ver referencia 19). También, Rs puede variar durante la grabaciones de la abrazadera del remiendo, otra vez conduce a cambios en la corriente registrada. Así, pueden ocurrir falsos positivos en situaciones donde Rs cambia durante el uso de la droga.
La electrofisiología en el tejido en rodajas se introdujo por el laboratorio de Andersen para estudiar características electrofisiológicas de las neuronas en el cerebro de 20. La técnica allanó el camino para investigaciones detalladas de las células así como circuitos comunicaciones y celular de la célula en un ambiente más intacto. Una técnica similar para hacer rebanadas de hipófisis fue introducida en 1998 por Guérineau et al. 21. sin embargo, no fue antes de 2005, que la preparación de corte de cerebro-pituitaria fue utilizada con éxito para estudios de patch-clamp en teleósteos 22. En este estudio, los autores también informaron el uso de grabaciones de la abrazadera del remiendo perforada. Sin embargo, en gran medida, la mayoría de las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias se han realizado en mamíferos y sólo un puñado de otros vertebrados, incluyendo peces teleósteos 1,2,22,23 . En teleósteos, casi todos los estudios fueron realizados en las células disociadas primarias 24,25,26,27,28,29,30 .
En el presente artículo, esbozamos un protocolo optimizado para la preparación de saludables rebanadas de cerebro-pituitaria de la medaka de pescado modelo. El enfoque representa varias ventajas en comparación con cultivos primarios de células disociadas. En primer lugar, las células se guardan en un medio ambiente relativamente preservado frente a disociarse de las condiciones de cultivo celular. En segundo lugar, preparaciones de corte nos permiten estudiar vías indirectas mediadas por célula comunicación 22, que no es posible en condiciones de cultivo de células disociadas. Además, demostramos cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas en los cortes de tejido obtenidos usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo con la anfotericina B como agente de formación de poro.
Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, se encuentran principalmente en Japón. La fisiología, la embriología y la genética de medaka se ha estudiado ampliamente por más de 100 años 31, y es un modelo de investigación utilizado en muchos laboratorios. De particular importancia para este trabajo es la distinta organización morfológica del complejo hipotálamo-hipofisario en los peces teleósteos: mientras que en mamíferos y aves las neuronas hipotalámicas suelte sus neuro-las hormonas que regulan las células endocrinas hipófisis en el sistema del portal de la eminencia media, hay una directa proyección nerviosa de las neuronas hipotalámicas en las células endocrinas de la hipófisis en los peces teleósteos 32. Así, cortar cuidadosamente realizados de cerebro-pituitaria es de particular importancia en los peces, lo que nos permite investigar características electrofisiológicas de las células hipofisarias en una bien conservada red de cerebro-pituitaria y las células de la pituitarias en particular cómo control de la excitabilidad y de tal modo homeostasis de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Se han realizado investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en numerosas especies de vertebrados, pero muy pocos en peces teleósteos. Entre éstos, la mayoría clara se han realizado en células disociadas de primarias. Para mejorar nuestra comprensión de las células hipofisarias como teleósteos, se comportan en un medio ambiente biológicamente más relevante, este protocolo muestra cómo preparar rebanadas de cerebro-pituitaria viables utilizando el medaka (Oryzias latipes) de pequeños peces de agua dulce. Hacer las rebanadas de cerebro-pituitaria, pH y la osmolalidad de las soluciones se ajustaron a valores que se encuentran en los fluidos corporales de peces de agua dulce viven en 25 a 28 ° C. Tras la preparación de la rebanada, el protocolo muestra cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo. La técnica de patch-clamp es una potente herramienta con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad, permitiendo la investigación de las propiedades eléctricas de las células intactas todo hasta canales de iones individuales. Parche perforado es el único que mantiene el medio intracelular intacto impide elementos reguladores en el citosol se diluye por la solución de electrodo pipeta patch. En cambio, cuando se realizan grabaciones de celulares tradicionales, se observó que las células pituitarias medaka pierden rápidamente su capacidad para disparar potenciales de acción. Entre las diferentes técnicas de perforación disponibles, este protocolo muestra cómo lograr la perforación de la membrana parcheada con el fungicida anfotericina B.

Este protocolo muestra un protocolo paso a paso de cómo lograr confiables grabaciones electrofisiológicas de las células de la pituitaria (gonadotrope), utilizando una línea transgénica de medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] donde el objetivo de las células (productoras de Lh gonadotropes) están marcados con proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, se llevaron a cabo las investigaciones electrofisiológicas con c...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

El artículo describe un protocolo optimizado para hacer rebanadas de tejido viable del cerebro-pituitaria, mediante el medaka (Oryzias latipes), de peces teleósteos y después las grabaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias mediante la técnica de patch-clamp con la configuración de parche perforado.

Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K vistas.  Norwegian University of Life Sciences. El artículo describe un protocolo optimizado para hacer rebanadas de tejido viable del cerebro-pituitaria, mediante el medaka (Oryzias latipes), de peces teleósteos y después las grabaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias mediante la técnica de patch-clamp con la configuración de parche perforado.

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Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Investigación

Neurociencias

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioingeniería

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...