Este trabajo fue apoyado por el NIH / NINDS subvención R01NS070159 (a TMD, JDL y ATS).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguieron el protocolo # A2011 09-003, que fue revisado, aprobado y supervisado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y Uso Comité. 1. Configuración del equipo <ol><li> Sistema de perfusión para la craneotomía Inmovilización del adulto requiere un sistema de intubación para entregar oxígeno disuelto a los peces. Una variedad de sistemas puede ser utilizado, pero se utiliza un sistema de gravedad simple que consiste en una jeringa de 60 ml. Elevar la presión de la cabeza a una altura que produce consistentemente una velocidad de flujo de 1 ~ ml / min. Esta jeringa se puede colocar en serie con las jeringas que luego se utilizan para el sistema de perfusión electrofisiológico. <ol><li> Obtener una 60 ml Luer del tubo de la jeringa de bloqueo y retire el émbolo. </li><li> Suspender la jeringa aproximadamente 8 in &amp;º 160, por encima de la base de un anillo-soporte mediante una abrazadera. </li><li> Conectar una llave de paso de un solo sentido para el extremo de la jeringa. Para el extremo opuesto de la llave de paso, conectar una pieza de tubo, 2 mm de diámetro, que es lo suficientemente largo como para extenderse a la base de la intubación. </li></ol></li><li> Sistema de perfusión para electrofisiología Para los experimentos electrofisiológicos, a menudo es necesario introducir una gran variedad de compuestos durante el curso de un experimento. Una variedad de sistemas están disponibles, pero un sistema de gravedad que consiste en 60 ml de jeringas en serie puede ser utilizado. Esta configuración permite una introducción simple, serie de soluciones que se llevarán a cabo mediante la apertura de la llave de paso correspondiente. <ol><li> Obtener dos o más 60 ml Luer jeringas de bloqueo y quite los émbolos de cada uno. Se requiere una jeringa para administrar agua hábitat para los peces, mientras que cada tubo subsiguiente se puede utilizar para administrar una variedad de compuestos farmacológicos para los peces. </li><li> Conecte cada jeringa a un 3 -manera llave de paso con una conexión Luer. </li><li> Utilice ⅛ en diámetro exterior del tubo (OD) para conectar las jeringas en serie con un bloqueo Luer macho en un extremo. </li><li> Asegure el dispositivo de tal manera que el cabezal de presión se eleva a una altura de 27 en encima de la base, o una altura que produce consistentemente un caudal de 1 ~ ml / min. </li></ol></li><li> Cánula de intubación La cánula de intubación facilita la introducción de fluido a los peces. Esta configuración proporciona la flexibilidad y la firmeza a la mejor posición de la cánula dentro de la boca del animal. <ol><li> El uso de cualquier par de tijeras en general (por ejemplo,. Fiskars) o una hoja de afeitar, quitar una sección de 1,5 cm desde el extremo ancho de una punta de pipeta P-200. </li><li> Inserte un trozo de tubo mm 6 cm x 1 en una válvula reductora con un tapón hembra Luer lock y la férula de silicona, es decir, un adaptador Tuohy Borst, e insertar esta cánula en la punta de la pipeta modificado. Sostenga la punta de la pipeta en posición con el Luer lock utilizando una corta porción de ⅛ en tubo de diámetro. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1.jpg" /> Figura 1 </li></ol></li><li> Base de intubación Este plato es utilizado para sostener el animal inmovilizado en una posición estable, en posición vertical y para facilitar la eliminación del fluido que entra en el animal a través de la intubación. Si esto no se ha establecido correctamente, se puede producir la puesta en común, lo que lleva a las señales vibratorias intrusivos en el registro electrofisiológico. <ol><li> Obtener el plato de base de un 100 mm x 15 mm placa Petri de plástico. </li><li> Utilizando una herramienta de soldadura, fundir un agujero, 6 mm de diámetro y 7,5 mm por debajo del borde de la llanta, en el lado del plato. Utilizando la misma herramienta, fundir un agujero, 10 mm de diámetro y 11 mm por debajo del labio del plato ~ 74 ° en sentido antihorario desde el<html> agujero más pequeño. Este agujero servirá como el orificio de drenaje. </li><li> Inserte un tubo, 1 cm de diámetro, en el agujero con el extremo levantado de tal manera que al final no puede ser bloqueada. A continuación, inserte una punta P-200 pipetteman en el pequeño orificio, lo que servirá como una cánula maniquí. </li><li> Con la placa de Petri ligeramente elevada en el lado del agujero más grande, se vierte la cera fundida enlatado en el plato de manera que el orificio de la cánula quede cubierto. La región servirá como un tope, lo que permite la cánula que se inserta ~ 3 mm en la boca de los peces. Esta puesta en marcha se debe permitir que se solidifique. </li><li> El uso de un borde de metal de llama calentado, tallar un canal para mantener el pescado de manera que el canal comienza a partir de la punta de la cánula y se extiende aproximadamente 1-2 pulg <ol><li> Se debe tener cuidado para asegurar que se forma un ángulo hacia abajo continua de la zona de cánula al puerto de drenaje.065fig2.jpg &quot;width =&quot; 400px &quot;/&gt; Figura 2 </li></ol></li></ol></li><li> Configuración de perfusión <ol><li> Antes de empezar, limpiar las perfusión set-ups con agua del hábitat, lo que garantiza que se eliminen todas las burbujas de aire. </li><li> Añadir ~ 30 ml de 0,016% (630 mM) solución tricaína a la configuración de la perfusión craneotomía y permiten ~ 2 ml a ejecutar a través de la tubería para asegurar que tricaína será entregado al animal tras el inicio de la perfusión. Ver el paso 2.2 de dilución. </li><li> Para la configuración principal de perfusión, agregue ~ 50 ml de agua de hábitat al primer tubo. Añadir todos los compuestos experimentales deseados a cada uno de los tubos restantes. </li><li> Coloque la configuración cánula en el pequeño orificio de la base de la intubación. </li><li> Gire un 1 en toda la franja de 42 cm Kimwipe en un espiral apretado y la inserta en el tubo de drenaje de forma que el Kimwipe extiende en ambos extremos. Este tejido servirá como una mecha para eliminar el líquido perfundido y para evitar la acumulación de fluido dentro de tque la intubación de base, lo que podría interferir con el registro electrofisiológico. </li><li> Inserte un extremo del tubo en el orificio grande de la placa de Petri, permitiendo que el extremo inferior de extender en un plato inerte que es lo suficientemente grande como para recoger todos los residuos de la perfusión. Este plato será el depósito de salida para la configuración. Coloque el tejido de manera que un extremo se encuentran cerca de la región del abdomen del animal y la extensión inferior puede gotear en el plato. </li><li> Coloque esta base de intubación completado cerca del microscopio de disección. Conectar el cierre Luer de la cánula para el tubo de perfusión tricaína. </li></ol></li><li> Capilar de la aguja y electrodos <ol><li> Obtener un electrodo primario que consiste en 2,5 en la de 0.010 en hilo de plata y un electrodo de secundaria que debe ser formada por 15 en el mismo cable a tierra a la instalación. Para el electrodo secundario, utilizar un 15 en la sección de 0,010 en alambre de plata con una punta soldada, que permite que quepaen la parte trasera de una etapa de la cabeza. <ol><li> Electrochapa las puntas de ambos los alambres de plata primaria y secundaria con los iones de cloruro. </li><li> El uso de un extractor de micropipeta, tire un borosilicato aguja capilar de pared delgada con una resistencia de &lt;15 mΩ. <ol><li> Llenar la aguja capilar con 2-3 l de 2 M de cloruro de potasio, o lo suficiente para cubrir parcialmente la punta cloruro recubierto de alambre de plata. </li><li> Inserte el electrodo primario en la cabeza del capilar y montarlo en el soporte del electrodo. </li><li> Monte la etapa de la cabeza en un micromanipulador y luego montar el electrodo secundario en un segundo micromanipulador. Con la instalación, la primera posición de cada electrodo y luego coloque la punta del electrodo de soldadura secundaria en la parte posterior de la etapa de la cabeza. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparación de las soluciones, sistema de perfusión, y electrofisiológico Equipo de grabación <ol><li> Obtener 1 L de agua hábitatdel acuario de los peces. </li><li> 0,016% T] metanosulfonato de tricaína (tricaína) (50 ml de 630 mM) 24. <ol><li> Descongelar una alícuota de 0,4% tricaína tamponada con Tris, pH 7,2. </li><li> Añadir 2,1 ml de 0,4% tricaína Tris-buffer a 47,9 ml de agua del hábitat y mezclar. </li></ol></li><li> Descongele concentración madre de deseado compuesto experimental soluble en agua (por ejemplo pentilentetrazol 300 mM, un chemoconvulsant común). </li><li> Descongelar una alícuota de 1 mg / l bromuro de pancuronio en solución de Ringer. </li><li> Llenar ambos sistemas de intubación experimentales con agua y hábitat anestesiante y drene por lo menos lo suficiente como para eliminar todas las burbujas de los tubos. Esto debe hacerse porque las burbujas obstruyen el flujo de fluido, que conduce a la asfixia del animal. <ol><li> Vaciar completamente los tubos de perfusión que sostendrán los medicamentos sin permitir que el aire en el tubo de conexión. </li><li> Llene el tubo anestesiante con 0,016% (630 M) solución tricaína y colocar cualquier expercompuesto imental (s) en el tubo adicional (s) en el sistema de perfusión experimental. <ol><li> El primer tubo de perfusión experimental debe contener sólo agua del hábitat. </li></ol></li></ol></li><li> Humedezca la pequeña esponja de poros con agua hábitat y colocar en un vacío de 60 mm x 15 mm placa de Petri. Este plato se utiliza para mantener a los peces mientras se inyecta el anestésico. </li></ol> 3. Craneotomía <ol><li> Agregar suficiente de la solución tricaína 630 M a un 15 x 60 mm placa de Petri para llenarlo aproximadamente tres cuartas partes del camino. Pesar el plato lleno. Esto se utiliza para inmovilizar el animal para que otros anestesia pueden ser inyectados por vía intraperitoneal. </li><li> Sumerja el animal en el plato que contiene tricaína y pesarlos de nuevo. <ol><li> Restar la diferencia entre los pesos de los pasos 1 y 2 para obtener el peso de los peces. </li><li> Permita que el animal permanezca en la solución tricaína hasta la calma y la mayor movimiento ha cesado. </li></ol></li><li> Con un par de pinzas grandes, traslado a los peces a la esponja prehumedecido y posicionar lateralmente. Transferencia de los peces por la cola funciona bien para este proceso. <ol><li> Coloque la esponja y los peces bajo el microscopio de disección. </li></ol></li><li> Con una jeringa Nanofil que contiene una aguja 34, mida lo suficiente bromuro de pancuronio tal que no es 1 g / g de peso del pez. </li><li> El uso de un palito de paleta a lo largo de la parte dorsal de los peces a mantenerla firme, administrar el bromuro de pancuronio intraperitoneal utilizando la jeringa Nanofil. </li><li> Usando las pinzas finas, coge el pez por la mandíbula y rápidamente transferir el animal a la base de la intubación. </li><li> Coloque el animal de modo que es dorsal-up en la forma de cera y de tal manera que la cánula 1 mm puede ser insertado en la boca. Utilice las pinzas finas para maniobrar el pescado y abrir la boca alrededor de la cánula. Debido a la composición de la bandeja de intubación, una parada se diseñó en la base, permitiendo que elcánula que se inserta 3 mm en la boca de los peces. <ol><li> Una vez en posición, encienda el tubo de perfusión por gravedad que contiene tricaína. </li></ol></li><li> Corte una sección de 3 cm2 de tejido Kimqipe y mojarlo con agua del hábitat. <ol><li> Coloque el tejido sobre el animal para evitar la desecación. La sección Kimwipe también puede ser posicionada para ayudar en la sujeción del animal dorsal plano. </li></ol></li><li> Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de primavera vanna para eliminar ~ 2 mm 2 sección del cráneo que cubre el techo óptico. Esta zona parece un plato oscuro y huesudo que se sienta detrás del ojo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3.jpg" width="400px" /> Figura 3 <ol><li> Inserte una hoja de la tijera vanna en el borde de la placa y empujar con la fuerza suficiente para la penetraciónte El hueso, sin perforar el cerebro. Cierre las tijeras para cortar el hueso. </li><li> Retire el trozo de hueso. </li><li> Si nada de sangre está presente, retire con el borde de un Kimwipe. El sangrado por lo general se detiene poco después de la realización de la craneotomía. </li></ol></li></ol> 4. Electrofisiología <ol><li> Cierre la llave de paso de la intubación y rápidamente desconectar el bloqueo Luer que conecta la base a la intubación por goteo tricaína. <ol><li> Mueva la configuración intubación intacta al microscopio electrofisiología y conectar con el sistema de perfusión. </li><li> Abra el agua y hábitat perfusión a una velocidad de 1 ml / min durante aproximadamente 1 hora, con el fin de lavar el tricaína. </li></ol></li><li> El uso de un micromanipulador bajo control visual, la posición del electrodo secundario de manera que la punta del electrodo se puede insertar en la fosa nasal del animal o en el baño detrás de la mandíbula superior. </li><li> Inserte la aguja del electrodo principal en la apertura craneotomía. Inserte elaguja en el tejido, de tal manera que la punta se posiciona bastante superficial en el techo óptico. <ol><li> Si el electrodo es demasiado profundo, la señal eléctrica puede ser pequeña. </li></ol></li><li> Recopilar y analizar la diferencia eléctrica registrada entre los electrodos de referencia primarios y secundarios. Este proceso permitirá que las grabaciones extracelulares que se obtengan. <ol><li> Recoge los datos en modo-Gap libre a una velocidad de muestreo de 5 kHz, con un filtro de paso bajo de 0.1 kHz y un filtro de paso alto de 1 Hz. </li><li> No comience a grabar la actividad electrofisiológica hasta que el agua del hábitat ha perfundido durante un mínimo de 45 min. </li><li> Grabación de una línea de base de la actividad nativa durante al menos 15 min antes de la adición de fármacos experimentales. Comenzar la perfusión con fármacos experimentales de elección y registro de la cantidad de tiempo deseado. En las preparaciones sanos, es posible grabar la actividad neurológica durante 2-3 h. </li></ol></li></ol> 5. Limpiar </p&gt; <ol><li> Al final del experimento, quitar los electrodos del cráneo y fosa nasal y eliminar la configuración de la intubación. <ol><li> La eutanasia a los animales por sobredosis de drogas utilizando tricaína de acuerdo con las prácticas aceptadas, como se indica por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). </li><li> El pez cebra que ser sacrificados debe ser colocado en una solución tricaína a 200-500 mg / L. Los peces son para ser dejado en la solución durante un mínimo de 10 minutos después de la cesación de la actividad opercular rítmica, después de lo cual se les somete a un medio físico de la eutanasia (transección de cuello uterino) para asegurar la muerte. </li></ol></li><li> Desconecte el bloqueo Luer conexión de la base de la intubación a la configuración de la perfusión. Recoger el líquido residual en el sistema de perfusión para su correcta eliminación. <ol><li> Deje correr el agua desionizada, a través de todos los tubos y recoger para su correcta eliminación, si peligroso. </li></ol></li><li> Para desinfectar el sistema de perfusión, rsin 70% de etanol a través de todos los tubos y recoger para su correcta eliminación. <ol><li> Agregar las llaves de paso para cada tubo en la posición abierta para facilitar el secado de aire. </li><li> Sumerja los electrodos en etanol al 70% y dejar secar al aire. </li></ol></li><li> Deseche la aguja capilar utilizado para el electrodo de primaria en un contenedor de objetos punzantes. </li><li> Desmontar la configuración de la intubación y enjuagar todas las piezas con agua. <ol><li> Limpie cada pieza con etanol al 70% y dejar secar al aire. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Henze, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+features+predicted+by+extracellular+recordings+in+the+hippocampus+in+vivo.">Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo.</a> J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).</li><li>Gabriel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+pattern+in+the+adult+zebrafish+spinal+cord+in+vitro.">Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro.</a> J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).</li><li>Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+brain+in+research+and+teaching:+a+simple+in+vivo+and+in+vitro+model+for+the+study+of+spontaneous+neural+activity.">The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity.</a> Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).</li><li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates.">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li><li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects.">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131, 759-768 (2005).</li><li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish.">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).</li><li>Maximino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).</li><li>Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).</li><li>Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orexin/hypocretin+system+in+zebrafish+is+connected+to+the+aminergic+and+cholinergic+systems.">The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems.</a> J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).</li><li>McLean, D. L., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+innervation+patterns+of+dopaminergic,+noradrenergic,+and+serotonergic+neurons+in+larval+zebrafish.">Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).</li><li>Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+central+nervous+cholinergic+system+of+a+neurogenetic+model+animal,+the+zebrafish+Danio+rerio.">The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio.</a> Brain Res. 1011, 156-169 (2004).</li><li>Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+properties+of+spinal+interneurons+in+embryonic+and+larval+zebrafish.">Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).</li><li>Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Functional+Connectivity+between+Neuronal+Ensembles+with+Larval+Zebrafish+Transgenic+for+a+Ratiometric+Calcium+Indicator.">Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator.</a> Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+statistical+methods+enhance+imaging+of+cameleon+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+cultured+zebrafish+spinal+neurons.">New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+gating+in+larval+zebrafish.">Sensorimotor gating in larval zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).</li><li>Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+retinal+pathways+drive+spatial+orientation+behaviors+in+zebrafish+navigation.">Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation.</a> Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).</li><li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+neurobiology:+how+larval+fish+orient+towards+the+light.">Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light.</a> Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).</li><li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+acuity+in+larval+zebrafish:+behavior+and+histology.">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8 (2010).</li><li>Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+and+motor+control+over+the+last+decade.">Zebrafish and motor control over the last decade.</a> Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).</li><li>Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+evidence+of+GABAA+and+GABAC+receptors+on+zebrafish+retinal+bipolar+cells.">Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells.</a> Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).</li><li>Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+evidence+of+GABAergic+neurons+in+parts+of+the+brain+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).</li><li>Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+regulation+of+odorant+receptor+gene+choice+and+subsequent+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurons+in+zebrafish.">Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Lazarova, M., Samanin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+by+yohimbine+of+pentylenetetrazol-induced+seizures+in+rats:+role+of+alpha+2+adrenergic+receptors.">Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors.</a> Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).</li><li>Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+technical,+biological+and+pharmacological+factors+in+the+laboratory+evaluation+of+anticonvulsant+drugs.+III.+Pentylenetetrazole+seizure+models.">The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models.</a> Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).</li><li>DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+of+pyrethroid+insecticides+in+zebrafish+embryos.">Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos.</a> Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).</li><li>Arnolds, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+effects+of+tricaine+on+the+supramedullary/dorsal+neurons+of+the+cunner,+Tautogolabrus+adspersus.">Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus.</a> Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Con la práctica, la actividad neuronal se puede observar constantemente, a pesar de las características (amplitud y la forma de eventos) de la actividad registrada pueden variar entre los peces. La utilización de la técnica de grabación extracelular puede explicar esta observación. El método proporciona control simultáneo de un gran número de células dentro de una región 1, por lo que las variacion...

En este artículo, un protocolo se describe para la obtención de grabaciones in vivo de la actividad neuronal en adultos de pez cebra. Se utilizan métodos de registro extracelular, proporcionando mediciones de voltaje de actividad eléctrica dentro de una pequeña región de tejido neural. Este método de investigación implica el seguimiento de un gran número de células en un animal de comportarse 1. Anteriormente, las grabaciones de división se han realizado en adultos y larvas, como lo han hecho los preparativos de la taza del ojo y grabaciones electrorretinograma. Estos experimentos se han realizado en gran medida al detalle las respuestas fisiológicas de diferentes sistemas sensoriales 2-5. Hasta hace poco, los preparativos cerebrales intactas sólo han estado disponibles para la realización de electrofisiología con 3,6,7 larva de pez cebra, que se puede producir la difusión de la respiración y el oxígeno a través de la piel. Nuestra preparación permite que la actividad neurológica nativa de un pez cebra adulto a medir mientras el animal sigue siendo plenamente consciente y consciente of sus alrededores. El pez cebra (Danio rerio) actualmente juegan un papel fundamental como modelo para estudios genéticos, toxicológicos, farmacológicos y fisiopatológicos 3. El pez cebra se han ganado visibilidad en el campo de la neurociencia, ya que comparten una amplia similitud con los mamíferos a nivel genético, neurales y endocrinas niveles 8. Durante la última década, las técnicas neuroanatómicas y inmunohistoquímicos estándar se han utilizado para determinar la organización característica detallada del sistema nervioso pez cebra 9-12 y de la distribución de los diferentes neurotransmisores 3,8,13. Más recientemente, los investigadores han cambiado su enfoque a los estudios funcionales 14,15, muchos de los cuales se centran en los procesos conductuales 16-19 y características electrofisiológicas de los sistemas sensoriales 2,13,20. Un pequeño número de estos estudios se han concentrado en la actividad eléctrica de las áreas específicas del adult cerebro del pez cebra 21-23, pero no se llevaron a cabo utilizando un enfoque in vivo. Este protocolo puede ser adaptado para estudios electrofisiológicos de tanto la actividad espontánea y evocada dentro del sistema nervioso pez cebra para describir los patrones de actividad en regiones específicas del cerebro. El uso de esta técnica permite que se hagan comparaciones entre la actividad neurológica de los estadios larvales y adultos jóvenes. Además, nuestro protocolo permite comparaciones entre alteraciones genéticas o farmacológicas. Junto con otros enfoques, como la ingeniería genética o pruebas farmacológicas, este método ofrece una nueva posibilidad para el análisis funcional de la comunicación neuronal y la plasticidad en el adulto animal intacto, así como para las aplicaciones potenciales, tales como el estudio de la epilepsia de inicio tardío o los procesos neurodegenerativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:91px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">2750HC</td>
			<td style="width:132px;">Dilute 100% to 70% with DI water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Potassium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">2 M Sodium Chloride</td>
			<td style="width:91px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:111px;">3624-05</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">0.4% Tris-Buffered Tricaine</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">E10521</td>
			<td style="width:132px;">pH 7.2-7.4; stored at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pancuronium Bromide</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1918</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 1 &#956;g/&#956;l in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:207px;">Habitat water</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 &#956;S; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">Pentylenetetrazol</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6500</td>
			<td style="width:132px;">Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Nanofil syringe</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">06A</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">34 G Beveled needle</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NF34BV</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Sponge</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Small pore and chemical-free</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:207px;">Foam-backed fine sand paper</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">5 x 5 cm2 is large enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">9 V Battery</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Wires with alligator clips</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">37 cm x 42 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KEM</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">11 cm x 21 cm Kimwipe</td>
			<td style="width:91px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:111px;">TW31KWP</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1/8 in diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 cm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">1 mm diameter tube</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule</td>
			<td style="width:91px;">Qosina</td>
			<td style="width:111px;">51505</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Microscope (Leica MZ APO)</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Another microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">Vanna scissors</td>
			<td style="width:91px;">Roboz Surgical Instruments Co., Inc.</td>
			<td style="width:111px;">15018-10</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:207px;">60 ml Luer lock syringe tubes</td>
			<td style="width:91px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:111px;">309653</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">3-way Stopcocks with Luer connections</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">1-way Stopcock with Luer connection</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NC9299146</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">S67961</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">4 in Borosilicate capillary tube</td>
			<td style="width:91px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">TW100F-4</td>
			<td style="width:132px;">Can contain a filament to aid in filling with solution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:91px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Digidata 1440</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axon Aloclamp 900A</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Axoclamp software</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">HS-9Ax 1U headstage</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">0.010 in Silver wire</td>
			<td style="width:91px;">A-M Systems, Inc.</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Q-series electrode holder</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;">QSW-A10P</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">10 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1 mm x 15 in Tubing</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:207px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:91px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;">Need 2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Microsoft-based PC</td>
			<td style="width:91px;">Dell</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Faraday Cage</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Air Table</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish

Anteriormente, los estudios electrofisiológicos en adultos de pez cebra se han limitado a cortar los preparados o de preparación para la Copa del ojo y grabaciones electrorentinogram. Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos, lo que permite la grabación de la actividad neuronal. Inmovilización del adulto requiere un mecanismo para entregar el oxígeno disuelto de las branquias en lugar del movimiento bucal y opercular. Con nuestra técnica, los animales se inmovilizan y perfundidos con agua hábitat para cumplir con este requisito. Una craneotomía se realiza bajo tricaína metanosulfonato (MS-222; tricaína) anestesia para facilitar el acceso al cerebro. El electrodo primario se coloca entonces dentro de la ventana de craneotomía para registrar la actividad cerebral extracelular. A través del uso de un sistema de perfusión de haces tubulares, una variedad de compuestos farmacológicos se puede administrar a los peces adultos y cualquier alteración en la actividad neuralse puede observar. La metodología no sólo permite observaciones que se hagan con respecto a cambios en la actividad neurológica, sino que también permite que se hagan comparaciones entre las larvas y adultos de pez cebra. Esto da a los investigadores la capacidad de identificar las alteraciones en la actividad neurológica debido a la introducción de diversos compuestos en diferentes etapas de la vida.

Este protocolo se ha usado para medir la actividad neuronal de adultos de pez cebra en vivo. Estos registros electrofisiológicos se consistente y reproducible obtenidos. Figura 5 muestra un ejemplo representativo de las alteraciones inducidas nativas y de la actividad neural de un pez cebra adultos cuando pentilentetrazol (PTZ), una chemoconvulsant común 6,7,25,26, se introduce en la intubación configuración. La actividad neurológica nativo del pez c...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish at JoVE.com

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

electrophysiological-recording-in-the-brain-of-intact-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.3K vistas.  University of Georgia.  Este artículo describe cómo un pez cebra adulto se puede inmovilizar, intubado, y se utiliza para in vivo experimentos electrofisiológicos para permitir grabaciones y la manipulación de la actividad neuronal en un animal intacto. 

Video: Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caracterización electrofisiológica de las buenas prácticas agrarias que expresan las poblaciones de células en la retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Investigación

Neurociencias

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Grabación electrofisiológica inalámbrica de las neuronas por tetrodes móviles en la natación libre de peces

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Microscopía de fluorescencia de tres fotones de tejido profundo en cerebro intacto de ratón y pez cebra

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...