El objetivo general de este procedimiento es etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de los peces teleost, y utilizamos perfusión cardíaca con un fijador que contiene DiI en la especie modelo medaka. Así que esta técnica que es simple y eficiente ayudará a responder preguntas importantes sobre la anatomía vascular en el cerebro y la hipófisis de los peces teleost, así como la relación entre las neuronas o células endocrinas y vasos sanguíneos. Algunas ventajas de esta técnica incluyen una preparación rápida y fácil y sencilla, y su adaptabilidad a las especies de peces teleost.
Para preparar un soporte de pescado, corte un trozo de poliestireno a una longitud de cinco centímetros, un ancho de tres centímetros y un grosor de dos centímetros, y pegue el poliestireno a una placa de plástico de nueve centímetros de diámetro. Luego usa un bisturí para hacer un agujero en forma de barco de tres centímetros en el poliestireno. Para preparar el sistema de perfusión, añada una cánula de plástico de 30 a 50 centímetros de largo en la extremidad de la aguja del sistema de perfusión.
Para preparar pipetas de vidrio de cinco centímetros, utilice un tirador de pipetas para estirar los capilares de vidrio individuales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes de comenzar la disección, cargue una jeringa de 10 mililitros con la solución fijadora de DiI preparada y coloque una aguja con una cánula en la extremidad de la jeringa. A continuación, utilice varias piezas de cinta colocadas en diferentes orientaciones para fijar la jeringa al banco, y ajuste la posición del microscopio y el asiento para obtener una buena posición para la disección y para presionar el pistón de la jeringa con el codo.
A continuación, coloque un pez eutanizado en el abdomen del porta peces hacia arriba y asegure la cabeza y la cola con alfileres. Usa tijeras para cortar horizontalmente la capa superficial de la piel para abrir el abdomen anterior, y usa fórceps para eliminar la piel por encima del corazón hasta que se logre un acceso claro al ventrículo y al bulbo arterioso. Añadir un tubo de vidrio en la extremidad del capilar y romper la punta de la pipeta.
Acerque el tubo de vidrio al ventrículo y agregue presión en el codo al pistón de la jeringa para forzar la salida del líquido mientras fija el ventrículo cardíaco con la pipeta. Luego perforar inmediatamente el seno venoso con fórceps para liberar la sangre de la circulación. Desde el ventrículo, ajuste el ángulo de la pipeta de vidrio para localizar la entrada del bulbo arterioso, y mueva la abertura de la pipeta dentro del bulbo arterioso.
A continuación, añada presión a la jeringa durante 30 a 60 segundos adicionales mientras mantiene la pipeta dentro del bulbo arterioso. Para un etiquetado óptimo de todos los vasos sanguíneos es fundamental perfundir en el bulbo arterioso el tiempo suficiente para reemplazar toda la sangre con la solución fijadora De DiI. Después de unos 60 segundos de perfusión, cuando no se observe más fugas de sangre, retire la pipeta de vidrio y las agujas del pescado, y cosechar el cerebro y la hipófisis en 4%paraformaldehído fresco durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, enjuague los tejidos dos veces en PBS fresco durante 10 minutos por lavado antes de preparar las muestras para la toma de imágenes. Después de la inyección cardíaca de una solución fijativa que contiene DiI como se ha demostrado, los vasos sanguíneos etiquetados se pueden observar en rodajas de tejido mediante microscopía estéreo fluorescente o en tejido entero mediante microscopía confocal. Tenga en cuenta que si la solución se inyecta en el ventrículo cardíaco en lugar del bulbo arterioso o si la solución se inyecta con una presión demasiado baja y/o durante un período demasiado corto, se observará un etiquetado inadecuado de los vasos.
Además, al tomar imágenes del mismo tejido con los mismos parámetros de imagen, se puede observar una disminución en la intensidad del etiquetado después de varios días, con la señal apareciendo más extendida dentro de la muestra de tejido. Las rebanadas de tejido de líneas transgénicas dentro de las cuales las células de interés expresan proteínas fluorescentes de reportero pueden etiquetarse aún más para proteínas específicas de interés utilizando protocolos de inmunofluorescencia estándar que permiten la investigación de interacciones entre los vasos sanguíneos y otros tipos de células. Es importante llegar al bulbo arterioso.
Cuando esto se logra, la adición de presión al pistón de la jeringa debe inducir una expansión del bulbo que confirme un procedimiento exitoso. Esta técnica se puede utilizar para investigar la interacción entre las células endocrinas y los vasos sanguíneos en la hipófisis del teleost en general, pero tal vez más específicamente para investigar posibles diferencias o similitudes entre los sistemas del portal en el teleost y los mamíferos. Debido a que este uso político compuestos tóxicos y volátiles precauciones tales como el uso de una máscara de gas y una habitación ventilada siempre debe tomarse al realizar estos procedimientos.
