Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares, como el monitoreo de la dinámica del crecimiento vascular del ingeniero y la remodelación durante el cultivo a largo plazo. La principal ventaja de utilizar la tomografía de coherencia óptica, o PTU, es que es una estrategia de imagen fácilmente disponible, en tiempo real y no destructiva para caracterizar las características estructurales y el proceso de remodelación de los recipientes de ingeniería. Demostrando el procedimiento también estarán Shangmin Liu, y Wentao Ma, técnicos de mi laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, fabrique el andamio PGA como se describe en el protocolo de texto Dip PGA andamifolds in a mol-per-litro de hidróxido de sodio durante un minuto, para ajustar la estructura espacial de la malla. Luego, remoje los andamios en agua de grado de cultivo de tejido tres veces durante dos minutos cada una. Cada vez, seque suavemente el andamio con un papel tisú.
Luego, seque los andamios en una capucha con un soplador durante una hora. Para ensamblar el biorreactor y la unión Y para la toma de imágenes OCT, primero, remoje el biorreactor cilíndrico de vidrio autodesarrollado, los andamios PGA, el tubo de silicona, los tubos biocompro compatibles, los conectores, la barra de agitación y el equipo para su montaje en un tanque de etanol del 95 por ciento durante dos horas. Tire del andamio PGA a través de los brazos laterales del biorreactor conectado a un lado con un conector, así como a otro lado con la unión y utilizada para entregar el cable guía OCT.
Montar otro andamio PGA en el biorreactor de la misma manera. Ajuste el politetrafluoroetileno en los labios del biorreactor apretando con 4-0 suturas. Vuelva a colocar el biorreactor en el tanque de etanol durante una hora antes de secarlo durante la noche en una capucha con el soplador puesto.
Ahora, aislar las células musculares lisas de la arteria umbilical humana de las arterias umbilicales humanas por técnicas de explantación estándar En la causa de salvar las células en andamios PGA, evitar cualquier goteo de suspensión celular en la parte inferior del biorreactor. Además, cubra el biorreactor con la tapa del tapón de silicona tan pronto como sea posible después del asiento de la célula para evitar la contaminación. Expandir y mantener las células en medio de crecimiento muscular liso.
Semilla de la arteria umbilical humana suaviza las células musculares a una concentración de 5 millones de células por mililitro en el medio de cultivo anterior en los andamios PGA. Después de colocar una barra de sir en el biorreactor, cúbrala la tapa del tapón de silicona que tiene un tubo de alimentación y tres segmentos de tubo cortos insertados para el intercambio de gas. Conecte los filtros de PTFE de 0,22 micras a cada tubo de cambio de aire y conecte una tapa de heparina al tubo de alimentación.
Ajuste la barra de agitación con una velocidad de agitación de 13 rondas por minuto. A continuación, monte el biorreactor de vidrio, la tapa del tapón de silicona y el andamio PGA en el sistema de cultivo. Deje que las células se adhieran durante 45 minutos inclinando el biorreactor cada 15 minutos con un soporte a la izquierda y a la derecha.
Ahora, conecte la bomba LOO-OH-YEE, la bolsa salina tamponada con fosfato y el conductor con los tubos biocompatibles para crear el sistema de profusión. Abra el controlador para llenar los tubos con PBS. Coloque el biorreactor general en una incubadora humidificada con un 5 por ciento de CO2 a 37 grados centígrados.
Llene la cámara de cultivo con 450 mililitros del medio de cultivo. Cultivar los andamios de semillas bajo cultivo estático durante una semana, cambiando el medio de cultivo cada tres a cuatro días aspirando la mitad del medio antiguo a través del tubo de alimentación y rellenando el reactor con una cantidad equivalente de medio de cultivo fresco. Para preparar el sistema de profusión para la toma de imágenes OCT, bombee fluidos en la bolsa PBS para que circulen a través de los tubos biocompatibles y vuelvan a la bolsa.
Abra la potencia del conductor y regule el ajuste de la bomba con una frecuencia de 60 latidos por minuto y una presión sistólica de salida de 120 milímetros de mercurio. Ajustar los parámetros mecánicos de acuerdo con las necesidades del cultivo vascular de ingeniería de tejidos. Haga clic en el botón Ejecutar para que el sistema de profusión funcione.
Proporcione la simulación pulsátil de fijación a los vasos durante tres semanas presurizando iterativamente los tubos biocompatibles después de una semana de cultivo estático. Utilice una fuente de luz para garantizar la resolución axial de diez a veinte micras y la profundidad de imagen de uno a dos milímetros para identificar la estructura de los vasos sanguíneos diseñados por tejidos, o TEBB, en función del dominio de frecuencia OCT intravascular sistema de imágenes. Encienda el interruptor de encendido y abra el software de captura de imágenes Conecte el catéter de imágenes de fibra óptica al motor de accionamiento y al controlador óptico, con la función de retirada automática del catéter.
Establezca los parámetros de la velocidad de adquisición de imágenes en diez fotogramas por segundo, con una velocidad de retroceso automática de diez milímetros por segundo. Ahora, conecte el catéter de imagen a la unión y a través de la tapa de la heparina con una aguja del calibre 18. Coloque el catéter en el tubo de silicona e identifique la estanqueidad de la estructura de la malla PGA antes de cargar el andamio PGA en el biorreactor.
Ahora, coloque la punta del catéter sobre la región de interés. Ajuste el dispositivo de retroceso y compruebe la calidad de la imagen. Adquiera imágenes en uno, cuatro, siete, diez, 14, 17, 21 y 28 días en cultura para cada TEBV individual.
Guarde estas imágenes secuencialmente con una observación en tiempo real de la microestructura TEBV, incluida la morfología de la superficie, la estructura interna y la composición. Repita la medición tres veces para obtener una medición fiable de los recipientes de ingeniería cada vez. Capture una serie de imágenes a lo largo de las pruebas utilizando el software de captura de imágenes.
Para utilizar el software de análisis de imágenes para medir el grosor de la pared de los vasos sanguíneos diseñados por tejidos, seleccione primero la imagen que se va a analizar. A continuación, haga clic en la herramienta de seguimiento para identificar automáticamente el lado interno del vaso sanguíneo diseñado por tejido con el software y esbozar manualmente el lado exterior. Aparecerá un diagrama de grosor en la pantalla.
Repita la medición cinco veces para obtener una medición fiable de las construcciones. Considere la posibilidad de utilizar dos investigadores independientes obligados a obtener información. Abra la tapa del tapón de silicona colocada sobre el biorreactor cuando el cultivo haya terminado y deseche el medio de cultivo.
Aflojar el politetrafluoroetileno de los labios del biorreactor y cortar los tubos de silicona desde el lado exterior del politetrafluoroetileno con tijeras. Cosecha los TEV del biorreactor y córtalos en secciones para un examen de microscopía de electrones de escaneo. Extraiga el tubo de silicona de soporte y fije las secciones con un 4 por ciento de formaldehído de potencia.
Realizar tinciones histológicas de rutina con tricromo de masajista y rojo sirious para examinar la morfología del colágeno y PGA. Para evaluar el contenido de PGA y el componente de colágeno, observe muestras histológicas con manchas rojas de sirio a través de un microscopio polarizado. Las imágenes de OCT se comparan con hallazgos histopatológicos de TEV después de cuatro semanas de cultura.
La imagen OCT muestra microestructura compacta y componentes específicos en comparación con la evaluación histológica. El medio de cultivo, el tubo de silicona, el TEBV y el fragmento de PGA son visibles. La tinción tricroma de Masson demuestra fibras de colágeno distribuidas en una dirección determinada, junto con restos de PGA en la capa de medios de los recipientes de ingeniería.
La tinción roja sirius revela restos de PGA y un componente de colágeno mediante el uso de un microscopio polarizado. Los micrografías de electrones de escaneo de recipientes de ingeniería demuestran una microestructura compacta. Mientras tanto, esta modalidad de imagen intraluminal adopta un monitoreo no destructivo y fácil de los TEV, incluyendo el proceso de remodelación y la morfología visual in situ en el cultivo de larga duración.
Como se muestra aquí, la remodelación se produce antes y los cambios morfológicos se manifiestan más obviamente en el grupo dinámico a través de la comparación del espesor teBV. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares exploren las características de la estructura y el proceso de remodelación a largo plazo de los vasos de ingeniería. La visualización clara de restos poliméricos mediante microscopía polarizada combinada con imágenes oct puede ser útil para evaluar la degradación de los andamios.
