Aquí presentamos un sistema automatizado basado en la tomografía de coherencia óptica o OCT. Esto nos permite monitorear la estructura de las biopelículas a grandes escalas espaciales o largos períodos de tiempo. La imagen de OCT es adecuada para resolver estructuras en el rango de micrómetros, sin embargo, actualmente está limitada a un área máxima de unos 250 milímetros cuadrados.
Las biopelículas a menudo superan esta escala, especialmente cuando la diferenciación es impulsada por gradientes ambientales a gran escala. La configuración experimental nos permite monitorear la morfogénesis tridimensional de biopelículas a grandes escalas espaciales y largos períodos de tiempo. El sistema es rápido, preciso y funciona de forma autónoma.
Estudiamos la morfogénesis de las biopelículas en los arroyos donde impulsan importantes procesos ecosistémicos. Sin embargo, el sistema se puede utilizar para estudiar biopelículas en otros sistemas naturales o entornos de ingeniería. El software para posicionamiento, adquisición de imágenes y análisis está escrito en Python.
Están disponibles a través de Jupyter Notebooks. Estas son soluciones fáciles de usar, de libre acceso y flexibles. Creemos que la representación visual de la configuración ayuda a otros usuarios a reproducir la instalación y a comprender mejor el software.
Esperamos que esto inspire a otros investigadores a adoptar enfoques similares. Aquí está una visión general de la instalación. El sistema se compone de un dispositivo de posicionamiento de precisión, la sonda OCT, y se monta alrededor de un flumo de plexiglás.
Comience por cablear el dispositivo de posicionamiento siguiendo las instrucciones publicadas en GitHub. Una vez conectado, instale el servidor GRBL como se describe en una página GitLab independiente. El sistema de posicionamiento ahora se puede controlar a través de esta página web;alternativamente se puede controlar a través de una secuencia de comandos de Python como se muestra en el ejemplo trabajado.
Coloque el ordenador y la unidad base OCT en un banco junto a la configuración experimental que contenga dispositivos microfluídicos, cámaras de flujo, flumos o sistemas de filtración. Si aún no está instalado, instale el sistema OCT junto con el software disponible tal como lo describe el fabricante. A continuación, instale los paquetes de software para la adquisición automatizada de análisis OCT como se describe en los documentos de GitLab vinculados aquí.
Para comenzar la adquisición de imágenes, monte la sonda de tomografía de coherencia óptica en el dispositivo de posicionamiento utilizando un soporte de cola de milano compatible. Si es necesario, instale un adaptador de inmersión en el objetivo y, a continuación, encienda el sistema OCT y el dispositivo de posicionamiento. Abra el software OCT comercial, localice un sitio de interés, concéntrese en la muestra y ajuste el brazo de referencia y la intensidad de la fuente de luz para obtener una calidad de imagen óptima.
Observe las coordenadas y repita este procedimiento para un número de posiciones mientras mantiene la misma longitud e intensidad del brazo de referencia. Abra ImageAcquisition. ipynb que se encuentra en el archivo suplementario 2 de este artículo en Jupyter Notebook.
Cada celda contiene código para realizar tareas específicas y se puede ejecutar por separado presionando Celda y luego Ejecutar o Controlar y Entrar o Mayús e Intro. Siga el ejemplo trabajado para establecer la ruta de acceso a las bibliotecas necesarias para conectar el dispositivo de posicionamiento para calibrar el dispositivo de posicionamiento para inicializar el escáner OCT. A continuación, ajuste los parámetros de adquisición, incluido el índice de refracción, el tamaño del campo de visión y el número de exploraciones A por exploración B.
Además, establezca los límites de señal de la exploración OCT en función de los histogramas de intensidad de los análisis preliminares y la carpeta de destino para los datos y metadatos adquiridos. Dependiendo del campo de visión y resolución, el tamaño del archivo puede alcanzar hasta 1,5 gigabytes por análisis de OCT. Estos dos parámetros determinan el tamaño de los vóxeles en el conjunto de datos final y el tamaño del archivo de salida.
Deben coincidir con la resolución óptica de la sonda OCT. Como se resalta en el ejemplo trabajado, puede adquirir un solo análisis OCT con parámetros predeterminados o adquirir un único análisis especificando un conjunto diferente de parámetros. También puede proporcionar coordenadas específicas para mover el dispositivo de posicionamiento y adquirir un solo escaneo OCT.
Esta característica le permite volver repetidamente a la misma posición exacta en el experimento con alta precisión espacial. Los datos se guardan en 8 bits. formato sin procesar para ahorrar espacio de almacenamiento.
Los metadatos, incluidas la configuración y las coordenadas de OCT, se guardan en la misma carpeta en un archivo json con la misma convención de nomenclatura. Como alternativa, especifique una lista de posiciones de interés y adquiera automáticamente los escaneos OCT respectivos. Con el fin de caracterizar las estructuras morfológicas de biopelículas a través de grandes gradientes ambientales, adquiera escaneos en un patrón de mosaico.
Para ello, especifique el número de teselas vecinas con una superposición predeterminada del 30% Los exámenes OCT sin procesar aparecen distorsionados. Esto se debe a las diferencias en la longitud del trayecto a través del sistema óptico. Desarrollamos un algoritmo que corrige esta distorsión como se muestra en los ejemplos trabajados.
Para comenzar la corrección de imagen, abra el bloc de notas de Jupyter ImageProcessing.ipynb. Siguiendo este ejemplo, primero recorte los escaneos OCT para excluir señales no esenciales y reorientar el conjunto de datos para que el biofilm aparezca encima del sustrato. Siguiente correcto para la aberración esférica.
Para lograr esto, el algoritmo localiza una superficie plana altamente reflectante en el análisis OCT y lo utiliza como referencia para aplanar los escaneos. A través de una cuadrícula de 20 por 20, el algoritmo identifica la máxima local en la intensidad de la señal para localizar la superficie de referencia. A continuación, se ajusta una superficie polinómica de segundo orden a través de estos puntos y se utiliza para desplazar cada píxel del escaneo OCT en dirección Z.
Los parámetros de este algoritmo deben ajustarse a las características del análisis OCT. Esta corrección permite una superficie de referencia homogénea en varias imágenes y, por lo tanto, facilita la costura de imágenes a gran escala. Una vez que la imagen ha sido aplanada, las imágenes se corrigen para el ruido de fondo mediante la identificación de un área vacía de la imagen por encima de la biopelícula y restando la intensidad media de fondo.
A continuación, calcule un mapa de elevación desde el conjunto de datos OCT 3D. Para ello, defina una superficie de referencia como el sustrato y elija un umbral de intensidad adecuado. A continuación, se representa un mapa de elevación con la altura del biofilm notificado como valor de escala de grises.
Si las imágenes se adquirieron en un patrón de mosaico, cose los mapas de elevación respectivos aplicando el algoritmo de costura. Utilizando imágenes OCT automatizadas, la morfogénesis espaciotemporal de las biopelículas de flujo fototrófico se examinó utilizando experimentos de flumo. Los flumos están hechos de plexiglás y se ensanchan gradualmente desde la entrada hasta la salida.
Esto da como resultado un gradiente en la velocidad de flujo. Aquí hay un mapa de elevación de una biopelícula que crece a lo largo de todo el gradiente de velocidad de flujo. Es importante destacar que el sistema automatizado de imágenes OCT permite una medición continua de parámetros estructurales como el espesor de la biopelícula, la rugosidad y el biovolumen en diferentes condiciones de flujo que van desde la velocidad de bajo flujo hasta las condiciones de velocidad de alto flujo.
Junto con los cambios morfológicos, el biovolumen promedio disminuyó significativamente en función de la distancia desde la entrada en el flumo. La calidad de los escaneos OCT depende críticamente de la longitud del brazo de referencia y de la distancia de enfoque. Es posible que deba reajustar este parámetro durante los experimentos.
Para garantizar la precisión del dispositivo de posicionamiento, recuerde realizar operaciones de localización regulares. Este dispositivo de imágenes automatizado se puede acoplar fácilmente con el perfilado de microsensores para una caracterización funcional de las biopelículas. OCT es una técnica de imagen emergente y anticipamos que el sistema presentado aquí estimula la investigación sobre la estructura del biofilm.
Esto puede ser relevante para tecnologías como el tratamiento de agua potable o el bioprocesamiento.
