Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale vascolare come il monitoraggio della dinamica della crescita vascolare dell'ingegnere e il rimodellamento durante la coltura a lungo termine. Il vantaggio principale dell'utilizzo della tomografia a coerenza ottica, o OCT, è che è una strategia di imaging prontamente disponibile, in tempo reale e non distruttiva per caratterizzare le caratteristiche strutturali e il processo di rimodellamento dei vasi ingegnerizzati. A dimostrare la procedura saranno anche Shangmin Liu, e Wentao Ma, tecnici del mio laboratorio.
Per iniziare questa procedura, fabbricare l'impalcatura PGA come descritto nel protocollo di testo Dip PGA impalcature in un idrossido di sodio mol per litro per un minuto, per regolare la struttura uciale della rete. Quindi, immergere le impalcature in acqua di coltura tissutale tre volte per due minuti ciascuna. Ogni volta, asciugare delicatamente l'impalcatura con una carta velina.
Quindi, asciugare le impalcature in un cappuccio con un soffiatore per un'ora. Per assemblare il bioreattore e la giunzione y per l'imaging OCT, in primo luogo, immergere il bioreattore cilindrico in vetro auto-sviluppato, impalcature PGA, tubo in silicone, tubi bio-compatibili, connettori, barra di agitazione e attrezzature per il montaggio in un serbatoio di etanolo al 95% per due ore. Tirare l'impalcatura PGA attraverso i bracci laterali del bioreattore collegati da un lato con un connettore, nonché su un altro lato con la giunzione y utilizzata per fornire il filo guida OCT.
Assemblare un'altra impalcatura PGA nel bioreattore allo stesso modo. Adatta il politetrafluoroetilene alle labbra del bioreattore stringendolo con 4-0 suture. Mettere di nuovo il bioreattore nel serbatoio dell'etanolo per un'ora prima di asciugarlo durante la notte in un cappuccio con il soffiatore ad acqua.
Ora, isolare le cellule muscolari lisce dell'arteria ombelicale umana dalle arterie ombelicali umane con tecniche standard di espianto Nella causa del salvataggio delle cellule in impalcature PGA, evitare qualsiasi gocciolamento della sospensione cellulare sul fondo del bioreattore. Inoltre, coprire il bioreattore con coperchio in silicone-tappo il prima possibile dopo la seduta cellulare per prevenire la contaminazione. Espandere e mantenere le cellule in un mezzo di crescita muscolare liscio.
Seminare le cellule muscolari lisce dell'arteria ombelicale umana ad una concentrazione di 5 milioni di cellule per millilitro nel mezzo di coltura di cui sopra sulle impalcature PGA. Dopo aver posizionato una sir bar nel bioreattore, coprirlo il coperchio del tappo in silicone che ha un tubo di alimentazione e tre brevi segmenti di tubi inseriti per lo scambio di gas. Collegare filtri PTFE da 0,22 micron a ciascun tubo di cambio aria e attaccare un tappo di eparina al tubo di alimentazione.
Regolare la barra di agitazione con una velocità di agitazione di 13 colpi al minuto. Quindi, assemblare il bioreattore di vetro, il coperchio del tappo in silicone e l'impalcatura PGA nel sistema di coltura. Lasciare aderire le cellule per 45 minuti appoggiando il bioreattore ogni 15 minuti con un supporto a sinistra e a destra.
Ora, collegare la pompa LOO-OH-YEE, il sacchetto salino tamponato con fosfato e il driver con i tubi biocompatibili al fine di creare il sistema di profusione. Aprire il driver per riempire i tubi con PBS. Posizionare il bioreattore complessivo in un incubatore umidificato con IL 5% di CO2 a 37 gradi Celsius.
Riempire la camera di coltura con 450 millilitri del mezzo di coltura. Far crescere le impalcature sementi in coltura statica per una settimana, cambiando il mezzo di coltura ogni tre o quattro giorni aspirando metà del vecchio mezzo attraverso il tubo di alimentazione e riempiendo il reattore con una quantità equivalente di mezzo di coltura fresco. Per preparare il sistema di profusione per l'imaging OCT, pompare fluidi nel sacchetto PBS per farli circolare attraverso i tubi biocompatibili e tornare alla borsa.
Aprire la potenza del driver e regolare l'impostazione della pompa con una frequenza di 60 battiti al minuto e una pressione sistolica di uscita di 120 millimetri di mercurio. Regolare i parametri meccanici in base alle esigenze della coltura vascolare di ingegneria tissutale. Fare clic sul pulsante esegui per far funzionare il sistema di profusione.
Fornire la simulazione pulsatile fissa ai recipienti per tre settimane pressurizzando iterativamente i tubi biocompatibili dopo una settimana di coltura statica. Utilizzare una sorgente luminosa per garantire la risoluzione assiale da dieci a venti micron e la profondità dell'immagine da uno a due millimetri per identificare la struttura dei vasi sanguigni progettati dai tessuti, o TEVB, in base al sistema di imaging intravascolare OCT del dominio di frequenza. Accendere l'interruttore di alimentazione e aprire il software di acquisizione delle immagini Collegare il catetere di imaging in fibra ottica al motore di azionamento e al controller ottico, con la funzione di ritiro automatico del catetere.
Impostare i parametri della velocità di acquisizione dell'immagine su dieci fotogrammi al secondo, con una velocità di pullback automatica di dieci millimetri al secondo. Ora, attacca il catetere di imaging alla giunzione y tramite il tappo dell'eparina con un ago calibro 18. Posizionare il catetere nel tubo di silicone e identificare la tenuta della struttura della rete PGA prima di caricare l'impalcatura PGA sul bioreattore.
Ora, posiziona la punta del catetere sulla regione di interesse. Regolare il dispositivo di pullback e verificare la qualità dell'immagine. Acquisire immagini in uno, quattro, sette, dieci, 14, 17, 21 e 28 giorni di cultura per ogni singolo TEBV.
Salva queste immagini in sequenza con un'osservazione in tempo reale della microstruttura TEBV, inclusa la morfologia della superficie, la struttura interna e la composizione. Ripetere la misurazione tre volte per ottenere una misurazione affidabile dei recipienti ingegnerizzati ogni volta. Acquisisci una serie di immagini durante il test utilizzando il software di acquisizione delle immagini.
Per utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare lo spessore della parete del vaso sanguigno progettato dai tessuti, selezionare innanzitutto l'immagine da analizzare. Quindi, fare clic sullo strumento di tracciamento per identificare automaticamente il lato interno del vaso sanguigno progettato dai tessuti con il software e disegnare manualmente il lato esterno. Sullo schermo apparirà un diagramma di spessore.
Ripetere la misurazione per cinque volte per ottenere una misurazione affidabile dei costrutti. Prendere in considerazione l'utilizzo di due investigatori indipendenti obbligati a ottenere informazioni. Aprire il coperchio del tappo in silicone posto sopra il bioreattore al termine della coltura e scartare il mezzo di coltura.
Allentare il politetrafluoroetilene dalle labbra del bioreattore e tagliare i tubi di silicone dal lato esterno del politetrafluoroetilene con le forbici. Raccogliere i TEBC dal bioreattore e tagliarli in sezioni per un esame di microscopia elettronica a scansione. Estrarre il tubo di silicone di supporto e fissare le sezioni con formaldeide di potenza del 4%.
Eseguire la colorazione istologica di routine con il tricromo di Masson e il rosso sirious per esaminare la morfologia del collagene e della PGA. Per valutare il contenuto di PGA e la componente collagene, osservare campioni istologici con colorazione rossa sirious attraverso un microscopio polarizzato. Le immagini oct vengono confrontate con i reperti istopatologici dei TEBV dopo quattro settimane di coltura.
L'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office mostra microstrutture compatte e componenti specifici rispetto alla valutazione istologica. Il mezzo di coltura, il tubo di silicone, il TEBV e il frammento PGA sono visibili. La colorazione tricromatica di Masson dimostra fibre di collagene distribuite in una certa direzione, insieme a resti di PGA nello strato mediale dei vasi ingegnerizzati.
La colorazione rossa sirius rivela resti di PGA e un componente collagene utilizzando un microscopio polarizzato. Le micrografie a scansione di elettroni di vasi ingegnerizzati dimostrano una microstruttura compatta. Nel frattempo, questa modalità di imaging intraluminale adotta un monitoraggio non distruttivo e facile dei TEBV, incluso il processo di rimodellamento e la morfologia visiva in situ in coltura di lunga durata.
Come mostrato qui, il rimodellamento avviene prima e i cambiamenti morfologici si manifestano più ovviamente nel gruppo dinamico attraverso il confronto dello spessore del TEBV. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale vascolare per esplorare le caratteristiche della struttura e il processo di rimodellamento a lungo termine dei vasi ingegnerizzati. Una chiara visualizzazione dei resti polimerici mediante microscopia polarizzata combinata con l'imaging OCT potrebbe essere utile per valutare la degradazione delle impalcature.
