이 방법은 엔지니어 혈관 성장의 역학을 모니터링하고 장기 문화 동안 리모델링과 같은 혈관 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광학 일관성 단층 촬영 또는 OCT를 사용하는 주요 장점은 엔지니어링 선박의 구조적 특징과 리모델링 과정을 특성화하기 위해 쉽게 사용할 수 있고 실시간 및 비파괴적 이미징 전략이라는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 또한 상민 리우, 그리고 웬타오 마, 내 실험실에서 기술자가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜Dip PGA 비계에 설명된 대로 PGA 스캐폴드를 리터당 1개의 몰당 수산화나트륨으로 1분간 제작하여 메시의 간격 구조를 조정합니다. 그런 다음, 각 2 분 동안 조직 배양 등급의 물에 세 번 비계를 담급니다. 매번 티슈 페이퍼로 비계를 부드럽게 두드려 말립니다.
그런 다음 블로어로 1 시간 동안 후드에 비계를 말리십시오. OCT 이미징용 생체 반응기와 y-접합을 조립하기 위해 먼저 자체 개발한 유리 원통형 생물 반응기, PGA 스캐폴드, 실리콘 튜브, 생체 호환 튜브, 커넥터, 저어줄 및 장비를 95% 에탄올 탱크로 조립할 수 있도록 2시간 동안 담가 둡니다. PGA 스캐폴드를 커넥터로 한쪽에 연결된 생물 반응기의 측면 팔과 OCT 가이드 와이어를 전달하는 데 사용되는 y-접합이 있는 다른 쪽으로 당깁니다.
같은 방법으로 생물 반응기에서 다른 PGA 비계를 조립합니다. 4-0 봉합사로 조이면 폴리테트라플루오로틸렌을 생물 반응기 입술에 맞춥시게 합니다. 에탄올 탱크에 생물 반응기를 다시 1 시간 동안 넣고 송풍기를 켜고 후드로 밤새 건조시십시오.
지금, 표준 각성 기술에 의하여 인간 탯줄 심연 근육 세포를 PGA 발판으로 저장하는 원인에서 인간 배꼽 동맥 평활근 세포를 분리, 생물 반응기의 바닥에 세포 현탁액의 떨어지는 것을 피하십시오. 또한, 오염을 방지하기 위해 세포 좌석 후 가능한 한 빨리 실리콘 스토퍼 뚜껑으로 생물 반응기를 덮습니다. 확장 하 고 부드러운 근육 성장 매체에서 세포를 유지.
상기 배양 배지에서 밀리리터당 500만 개의 세포-밀리리터의 농도로 인간 배꼽 동맥 평활근 세포를 종자위에 PGA 스캐폴드에. 생물 반응기에 sir 막대를 놓은 후, 1개의 수유 튜브와 가스 교환을 위해 삽입된 3개의 짧은 튜브 세그먼트가 있는 실리콘 스토퍼 뚜껑을 덮습니다. PTFE 0.22 미크론 필터를 각 공기 변화 튜브에 부착하고 먹이 튜브에 헤파린 캡 하나를 부착합니다.
분당 13라운드의 교반 속도로 교반 바를 조정합니다. 그런 다음 유리 생물 반응기, 실리콘 스토퍼 뚜껑 및 PGA 스캐폴드를 배양 시스템으로 조립합니다. 세포가 15분마다 왼쪽과 오른쪽으로 스탠드로 생체 반응기를 기울여 45분 동안 부착할 수 있도록 합니다.
이제 LOO-OH-YEE 펌프, 인산염 완충식식염수백, 드라이버를 생체 적합성 튜브와 연결하여 증혈 시스템을 생성합니다. 드라이버를 열어 PBS로 튜브를 채웁니다. 전체 생물 반응기를 37도에서 5% CO2로 가습된 인큐베이터에 배치합니다.
배양 배지의 450 밀리리터로 배양실을 채우는 다. 1주일 동안 정시 배양하에서 종자 비계를 성장시키고, 배양 배지의 절반을 먹이튜브를 통해 3~4일마다 변경하고 반응기를 상응하는 양의 신선한 배양 매체로 리필한다. OCT 이미징을 위한 풍부 시스템을 준비하려면 PBS 백에 유체를 펌핑하여 생체 적합성 튜브를 통해 다시 백으로 순환시합니다.
드라이버의 힘을 열고 분당 60비트의 주파수와 120mm의 수은의 출력 수축기 압력으로 펌프 설정을 조절합니다. 조직 공학 혈관 배양의 요구에 따라 기계적 매개 변수를 조정합니다. 실행 버튼을 클릭하여 풍부 시스템을 작동시합니다.
정적 배양 1주일 후 생체 적합성 튜브를 반복적으로 가압하여 3주 동안 용기에 대한 고질 시뮬레이션을 제공합니다. 광원을 사용하여 10~20마이크로톤의 축 분해능과 1~2밀리미터의 이미지 깊이를 보장하여 주파수 도메인 OCT intravascular 이미징 시스템을 기반으로 조직 으로 설계된 혈관 또는 TEVB의 구조를 식별합니다. 전원 스위치를 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 열어 카테터 자동 후퇴 기능을 사용하여 광섬유 이미징 카테터를 드라이브 모터 및 광학 컨트롤러에 연결합니다.
초당 10밀리미터의 자동 풀백 속도로 이미지 획득 속도의 매개 변수를 초당 10프레임으로 설정합니다. 이제 18게이지 바늘로 헤파린 캡을 통해 이미징 카테터를 y-접합에 부착합니다. 카테터를 실리콘 튜브에 넣고 PGA 스캐폴드를 생물 반응기에 로드하기 전에 PGA 메시의 구조 적 압박감을 식별합니다.
이제 카테터 팁을 관심 지역에 배치합니다. 풀백 장치를 조정하고 이미지 품질을 확인합니다. 각 개별 TEBV에 대해 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21 및 28일 의 문화에서 이미지를 수집합니다.
표면 형태, 내부 구조 및 조성물을 포함하는 TEBV 미세 구조의 실시간 관찰을 통해 이러한 이미지를 순차적으로 저장합니다. 매번 엔지니어링 된 선박의 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 세 번 측정을 반복합니다. 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 테스트 전체에서 일련의 이미지를 캡처합니다.
화상 분석 소프트웨어를 사용하여 조직 으로 설계된 혈관 벽 두께를 측정하려면 먼저 분석 할 이미지를 선택하십시오. 그런 다음 추적 도구를 클릭하여 소프트웨어로 조직 으로 설계된 혈관의 내부 측면을 자동으로 식별하고 바깥쪽을 수동으로 스케치합니다. 두께 다이어그램이 화면에 나타납니다.
구조를 신뢰할 수 있도록 5회 측정을 반복합니다. 획득 정보에 의무가 있는 두 명의 독립적인 조사관을 사용하는 것이 좋습니다. 배양이 완료되면 생체 반응기 위에 놓인 실리콘 스토퍼 뚜껑을 열고 배양 배지를 폐기한다.
생물 반응기 입술에서 폴리테트라플루오로틸렌을 풀고 폴리테트라플루오로틸렌의 바깥쪽에서 가위로 실리콘 튜브를 자릅니다. 생물 반응기에서 TEBV를 수확하고 스캐닝 전자 현미경 검사를 위한 섹션으로 잘라냅니다. 지지 실리콘 튜브를 꺼내 4%의 파워 포름알데히드로 섹션을 수정합니다.
콜라겐과 PGA의 형태를 검사하기 위해 매슨의 삼색과 sirious 빨간색으로 일상적인 조직학적 염색을 수행합니다. PGA 함량과 콜라겐 성분을 평가하려면 편광 현미경을 통해 심오한 붉은 염색으로 조직학적 샘플을 관찰하십시오. OCT 이미지는 4 주 간의 문화 후 TEBV의 조직 병리학 적 발견과 비교됩니다.
OCT 이미지는 조직학적 평가와 비교하여 소형 미세 구조 및 특정 구성 요소를 보여줍니다. 배양 배지, 실리콘 튜브, TEBV 및 PGA 단편이 표시됩니다. 마슨의 삼색 염색은 엔지니어링 선박의 미디어 레이어에 있는 PGA 잔재와 함께 특정 방향으로 분포된 콜라겐 섬유를 보여줍니다.
시리우스 붉은 얼룩은 편광 현미경을 사용하여 PGA 잔재와 콜라겐 성분을 보여줍니다. 엔지니어링 된 선박의 스캐닝 전자 현미경 사진은 소형 미세 구조를 보여줍니다. 한편, 이러한 인트라루컬 이미징 양식은 장기 간의 문화에서 시상 교정 과정 및 시각적 형태학을 포함하여 TEBV의 비파괴적이고 쉬운 모니터링을 채택합니다.
여기에 표시된 바와 같이, 리모델링은 일찍 발생하고 형태학적 변화는 TEBV 두께의 비교를 통해 동적 그룹에서 더 명백하게 나타납니다. 이 기술은 혈관 조직 공학 분야의 연구원들이 구조 기능과 엔지니어링 된 선박의 장기 리모델링 과정을 탐구할 수있는 길을 열어줍니다. 100억 화소 이미징과 결합된 편광 현미경검사에 의한 중합체 잔재의 명확한 표시는 비계 분해를 평가하는 데 유용할 수 있다.
