이 연구는 국립 연구소의 건강 K22 AI110552 NVK에 게 수 여 및 암 예방 연구 텍사스 연구소 (CPRIT) 수상 RR150044, 웰 치 재단 연구 그랜트 C-1930 년에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

주의: 피 녹 농 균 과 E. faecalis 는 Biosafety 수준 2 병원 체, 그리고 우연한 감염을 방지 하 고 표면 오염 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치는가지고 야 한다. 모든 미디어 자료와 병원 균에 접촉 해야 합니다 수 소독 및/또는 삭제. 추가 지침 CDC 간행물 Biosafety Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL), 5 판에서에서 사용할 수 있습니다.
1. 준비 및 피 녹 농 균 의 유지 보수
<ol><li>파운드 (Lysogeny 국물) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 행진 P. 녹 농 균 37 ℃에서 16 ~ 24 h를 품 어 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 P. 농 균 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에이 접시를 전송 이 접시 4 ° C에서 유지 고 1 주일 문화를 예방 하는 데 사용 될 수 있습니다. 1 주일 후 오염을 제거 하 고 접시를 버리고 새로운 파운드 조 흔 격판덮개를 만들. 참고: 피 녹 농 균 독성 장기간된 보관 후 감소합니다.</li>
	<li>분석 결과 접시를 설정 하기 전에 2 일 1.1에서 만든 접시에서 피 녹 농 균 에의 한 식민지와 살 균 파운드 국물의 3-5 mL 접종. 12 ~ 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 16 h 이상 품 어 하지 마십시오. 풍부한 액체 문화에서 P. 농 균 PA14 lyse 하기 시작 합니다.</li>
	<li>천천히 죽 일 미디어와 함께 살 균 10 cm 접시를 준비 (3 세대 NaCl, 3.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M)의 고 KH2포4 (1 M)의 868 mL)와 18 g 천/L). 참고: 미리 접시를 준비 합니다. 그들은 최대 3 주까지 4 ° c.에 밀폐 용기에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>각 10 cm 느린 죽 플레이트 (SK 판) P. 녹 농 균 의 신선한 하룻밤 파운드 문화에서 350 μ와 씨앗 살 균 세균 분산기를 사용 하 여 미디어의 표면에 걸쳐 균일 하 게 박테리아를 확산 하 고 BSL-2 생물 안전 캐비닛에 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>2입니다. RNAi 박테리아의 준비
<ol><li>밖으로 행진 또는 냉동된 재고에서 적절 한 항생제 (100 µ g/mL에서 carbenicillin) 및 Ahringer와 비 달 라이브러리 15 µ g/mL에서 항생물질을 포함 하는 파운드 한 접시에 RNAi를 포함 하는 박테리아의 핀 전송 원하는 변종. 참고: nonpathogenic 박테리아를 작업할 때 사용 하거나 BSL-2 A / B 생물 안전 캐비닛 또는 BSL-1 층 류 후드 문화의 무 균을 보장 하 고 라이브러리의 교차 오염의 가능성을 최소화 하기 위해.</li>
	<li>37 ° c.에 24 h에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장.<ol>
<li>2 주 후 번호판을 삭제 하 고 갓 만든 번호판 교체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개의 단일에서 파운드 carbenicillin 보충의 4 mL 또는 멸 균 시험관에 각 복제에서 단일 식민지를 개별적으로 접종 하 여 동시에 여러 RNAi 긴장을 테스트 합니다. 참고: 항생물질은 RNAi의 효율성을 감소 시키기 위하여 알려졌다. 이 미디어에 그것을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>24 잘 깊은 잘 격판덮개 multiwell 격판덮개를 위한 최적화 된 떨고 인큐베이터에 배치 하 고 950 rpm에서 떨고 있는 동안 16 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 그것은 기존의 떨고 인큐베이터를 사용 하 여 multiwell 격판덮개에 균일 한 박테리아의 성장을 얻기 어렵다입니다. 떨고 인큐베이터에서 제대로 성장 하는 문화에 대 한 순서로 750 rpm의 최소 흔들 수 있이 필요가 있다. 특수 셰이 커의 부재에서 개별 튜브에서 각 문화를 성장 가능 하다. 원하는 경우 문화 그 후, 원심 분리에 대 한 24-잘 접시로 옮겨질 수 있다.</li>
	<li>2000 x g에서 5 분간 centrifuging 여 박테리아를 수집 합니다.</li>
	<li>접시를 반전 하 고 적극적으로 흔들어 하 여 상쾌한을 가만히 따르다. RNAi 박테리아의 S 기저 (5.85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2포4 초순 물 1 L에 녹이 고 압력솥에 의해 소독) 100 µ L resuspend</li>
	<li>NGM multiwell 격판덮개의 우물의 적절 한 수로 resuspended 박테리아를 플라스틱 (선 충 류 성장 매체, 3 세대 NaCl, 2.5 g 펩, 1mm CaCl2, 1 mM MgSO4, 인산 염 버퍼의 25 mL (리터 당 금액: 132 mL K2HPO4 (1 M) 그리고 KH2포4 (1 M)의 868 mL), 및 물의 리터 당 18 g 천) IPTG (1mm 최종 농도)와 carbenicillin (100 μ g/mL 최종 농도) 보충.<ol>
<li>6 잘 플레이트, 24-잘 접시의 우물 당 1 mL 또는 96 잘 접시의 당 150 µ L의 당 NGM 미디어의 3.5 mL를 사용 합니다.</li>
		<li>6 잘 플레이트;에 대 한 박테리아의 100 μ/잘 사용 50 μ/잘 24-잘; 또는 96 잘 접시 20 μ/잘. 건조를 허용 합니다. 참고: 건조 신속, 균일 한 건조를 촉진 하는 살 균 흐름 후드에서 정상적으로 수행 됩니다. 균일 건조 하는 것은 매우 중요 하다입니다. 벌레의 소리를 내는 agar에 균열 촉진으로 지나치게 건조 하지 마십시오. 웜 및 액체 처리 시스템의 잠재적인 막힘을이 끈다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 된 접시를 사용 하 여 즉시 또는 나중에 사용에 대 한 최대 2 주 동안 그들을 4 ° C에서 저장. 참고: 접시 밖으로 건조 하지 않도록, 그들은 수 수 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉 또는 젖은 종이 타월로 단단히-밀폐 된 용기에 배치.</li>
</ol>3. 유지 보수 및 C. 선 충 의 준비
참고: 실험을 시작 하기 전에 생성 벗, 성인 자웅 동체 벌레의 동기화 된 인구 다음과 같습니다.
<ol><li>세척 벗 성인 (즉, 여러 개의 배아 생식 내 표시와 함께) 4-6-10cm NGM 번호판 플레이트, 부드럽게, 소용돌이 그리고 다음 15 mL 원뿔 튜브에 붓는 S 기저의 4 mL를 추가 하 여 15 mL 원뿔 튜브로에서.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리를 통해 웜 작은</li>
	<li>Aspirate 상쾌한, 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용</li>
	<li>웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL을 추가 (최종 농도 0.5 M NaOH, 살 균 물에 1% 염소) 웜 펠 릿을 1 분에 대 한 반전에 의해 혼합.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고 30 초 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>발음 또는 웜 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>웜 펠 릿에 신선한 웜 표 백제 솔루션의 3.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>적극적으로 혼합 표 백제 솔루션에서 벌레. 주기적으로 (약 매 10 초) 육안으로 직접 검사 해 현미경 벌레. 계란을 풀어 휴식, 웜 손톱에 대 한 감시. 성인 벌레의 대부분 해산된 (~ 95%) 되어, 일단 S 기저 막을 소화와 15 mL에 표 백제를 희석. 참고: 달걀 껍질은 성인 조직 보다 표 백제에 저항 하지만 그들은 장기간된 노출 시 녹을 수 있다. 계란 해체를 방지 하려면 표 백제 솔루션 7 분 이상 벌레 계란을 노출 하지 마십시오. 달걀 껍질은 과도 하 게 손상 된 경우, 태아 죽을 것 이다.</li>
	<li>30 초 동안 1000 x g에서 배아를 작은 발음 또는 배아의 펠 릿을 제거 하지 않고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>나머지 표 백제 솔루션을 희석을 S 15 mL의 최종 볼륨을 기저에 벌레를 resuspend.</li>
	<li>4 연속 세척의 총에 대 한 세척 단계 (3.9-3.10) 3 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>4 세척 후 상쾌한 발음 하 고 15 mL 원뿔 튜브로 살 균 S 기저의 5 또는 6 mL 추가 합니다. 목표는 배아 µ L 당 50 ~ 벌레의 농도를 resuspend 것입니다. 참고: S 기저의 금액; 계란 펠 릿의 크기에 따라 달라 집니다. 큰 펠 릿 더 S 기저는 필요 합니다.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 테이블 탑 회전 또는 15 ° c.에서 48 h에 원뿔 튜브를 품 어 애벌레는 부 화 하지만 애벌레 개발 L1 단계 (L1 diapause) 영양소 부족 때문에 체포 됩니다.</li>
	<li>그들의 대부분 부 화 하 고 개발의 L1 단계에서 체포는 확인 해 현미경 배아를 검사 합니다.</li>
	<li>웜 준비의 20 µ L S 기저의 80 µ L와 희석 함으로써 웜 수를 결정 합니다. 빈 NGM 접시에 직접 희석된 웜 솔루션의 10 µ L 플라스틱 2 번 더 반복 합니다.<ol>
<li>각 자리에 애벌레를 계산 하 고 평균 수를 결정 합니다. 이 평균 웜 준비 µ L 당 벌레의 대략적인 개수를 2로 나눕니다. 웜 preps 전파 격판덮개 또는 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 참고: 4-5 일 후 굶 어 애벌레 시작 됩니다 죽을; 이 시점에서 준비를 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>변형 전파, L1 웜 (5000-6000) 3-4 10-cm NGM 접시에 적절 한 수와 함께 발견 하는 피 펫 OP50 대장균- "superfood" 집중 (대장균 OP50 25 X 농도에서 발견 (즉, 1 L 1 박 OP50의 LB에서 성장 하는 문화 수익률 25 X OP50 superfood의 40 mL); 이 집중된 세균 현 탁 액 2 mL 각 10 cm NGM 접시에 발견).</li>
	<li>실험에 대 한 접시를 준비 하려면 ("기본 프로토콜" 사용 3.17.1 설치, "RNAi 스크린 설정" 사용 단계 3.17.2-적절 한 3.17.4에 대 한)에 대 한 다음 중 하나를 수행 합니다.<ol>
<li>피 펫 ~ 5000 웜/10 c m 플레이트 RNAi 또는 OP50 superfood로 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 500 웜/잘 6 잘 플레이트 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 300 웜/잘 24-잘 접시에에서 RNAi와 시드.</li>
		<li>피 펫 ~ 100 웜/잘 96 잘 접시에에서 RNAi와 시드. 참고: RNAi는 시드 방법에 대 한 지침을 참조 하십시오 단계 2.7-2.9 RNAi 박테리아의 준비에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 비옥한 변형 사용 되 고, 품 어 벌레 ~ 44-48 h. 사용에 대 한 25 ° C에서이 벌레 가능한 한 빨리 후 인구는 적절 한 나이 도달 했습니다. 이 분석 결과 중 벌레 내에서 부 화 계란의 영향을 최소화 합니다.</li>
	<li>변형 사용 하는 경우는 살 균 온도 (예: fer-15(b26); fem-1(hc17) 또는 glp-4(bn2)), 벌레 ~ 16 h 15 ° C에서 품 어와 다음 44 h 개발을 완료 하 고 embryogenesis를 방지를 위한 25 ° C에 전송.</li>
</ol>4. 액체 분석 결과 설치 (기본 프로토콜)을 죽이
참고: 이것은 하나의 박테리아 스트레인과 벌레의 한 소스에 대 한 프로토콜입니다.
<ol><li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 SK 접시에서 피 녹 농 균 을 제거 하 고에 resuspend ~ S 기저의 5 mL. 필요한 경우 규모. (OD600) 분 광 광도 계를 사용 하 여 세균 현 탁 액의 광학 밀도 측정</li>
	<li>S 기저 OD600 ≈ 0.09에 (3 배 최종 농도)에 피 녹 농 균 의 희석된 증권의 24 mL를 준비 합니다. 잘, 당 최종 콘텐츠 4.6.2 참조 하 고 따라 세균 희석의 볼륨을 확장할.</li>
	<li>액체 느린 죽 미디어 (3 g의 NaCl, 펩/L CaCl2 와 1 m m의 최종 농도에 MgSO4 보완의 3.5 g) 21 mL를 추가 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 박테리아와 미디어의 45 µ L 384-잘 접시의 각 잘 전송.</li>
	<li>50 mL 원뿔 관으로 (즉, 단계 3.17.1) 그들의 소스에서 벌레를 세척 하 고 벌레를 중력 아래 정착을 허용. 5 mL에 상쾌한 발음 Resuspend 50 mL S의 총 기초</li>
	<li>4.4 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>웜 정렬을 사용 하 여, 약 22 웜 384-잘 접시의 각 음에 정렬 합니다. 참고: 설치 ~1.1 µ L의 액체에서 각 벌레를 삭제합니다. 22 벌레 25 µ L, 총 분석 결과 볼륨 70 µ L/잘 데리고 도달할 것 이다.<ol>
<li>각 잘의 최종 구성 구성 70 µ L. 45이이 볼륨의 µ L 세균성 매체로 추가 (24 µ L S 기초, 및 21 µ L SK에서에서 0.03 OD600 박테리아 CaCl2 와 MgSO4보충). 다른 25 µ L 22 벌레와 함께 추가 됩니다.</li>
		<li>정렬 사용 하는 경우 여기 ( 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다, 웜 웜 1 µ S 기저 에/L pipetted 25 µ L/잘 사용 하 여 멀티 채널 피 펫의 최종 농도에 희석 수 있습니다. 그러나, 결과 증가 다양성을 전시할 지도 모른다. 또는, 양조위와 동료19에 설명 된 대로 연동 액체 디스펜서를 사용 하 여 가능 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 후 가스 투과성 필름으로 접시를 봉인 하 고 24-48 h 25 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>원하는 시간에 사용 하 여 microplate 세탁기 S 기저와 384-잘 접시 세척 5 회 총.<ol>
<li>두 번째 세척 후 발음 미디어의 대부분, 격판덮개 우물의 아래에서 어떤 파편 든 지를 풀고 30 초 이상 microplate vortexer를 사용 하 여 흔들 ~ 20 µ L. 적극적으로 떠나).</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 세척, 20 µ L. 추가 50 µ L 0.98 µ M 핵 산의 아래 aspirate 상쾌한 얼룩 ( 재료의 표참조) 후 / 384-잘 접시 0.7 µ M의 최종 농도 대 한의.</li>
	<li>12-16 h에 대 한 실 온에서 품 어. 이 염료는 죽은 벌레를 얼룩만 것 이다. 원하는 잠복기, 후 microplate 세탁기를 사용 하 여 어떤 과잉을 제거 하는 세척 접시 (최소 3 세척) 얼룩.</li>
	<li>데이터 수집을 위한 이미지 전송된 빛과 형광 (531 nm 여기 및 593 방출) 하는 분 광 광도 계 또는 자동화 된 현미경을 사용 합니다.<ol>
<li>낮은 배율 목표를 사용 하 여 이미지 캡처 전체 잘 수 있도록.</li>
		<li>또는, 흐름 vermimetry를 사용 합니다. 이 기술은 크기와 강하게 cytometry 비슷한 패션에 (즉, C. 선 충) 모든 생물의 형광 측정 웜 fluorimeter 대형 개체 흐름 cytometer를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자동된 이미지 분석 소프트웨어 (예: CellProfiler, MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>에 따라 무료 이미지 분석 스튜디오)을 사용 하 여 형광 및 총 웜 지역 편견된 패션에 잘 당 계산 하. 참고:이 숫자의 지 수 각 잘 분수 죽음을 나타냅니다. 하나 잘 했다면 7 스테인드 20 개 벌레 총, 0.35 또는 35%를 구성 하는 분수 죽음 다음.<ol>
<li>처음 사용 전에 수동 채 점 하 여 자동된 이미지 처리 파이프라인의 유효성을 검사 해야 합니다. 이것은 자동화 된 파이프라인에서 점수 시각 이미지를 검사 하 고 그들 각각의 죽은 벌레의 분수를 기록 하 여 얻은 결과 비교 하 여 이루어집니다. 유효성 검사 프로세스 보장 자동된 이미징 처리에 대 한 매개 변수가 정확 하 고 올바르게 데이터를 표현 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 여러 심사 C. 선 충 종자 또는 Knockdowns (RNAi 스크린 설치)에 대 한 적응
참고: 이것은 24-잘 접시 설치에 대 한 설명 하는 RNAi 스크린입니다.
<ol><li>24-잘 접시의 당 S 기저의 1 mL를 추가 (하십시오 단계 3.17.3 참조). 부드럽게 접시를 떨고 하 여 벌레를 선동 한 다음 웜 빈, 살 균 24 깊은 잘 격판덮개 전송. 웜 (~ 5 분)가 정착을 허용 합니다.</li>
	<li>약 1 mL을 떠나 상쾌한 발음 각 우물에 S 기초의 7 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>5.1-5.2 최소 2 번의 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 약 400 µ L를 떠나 발음.</li>
	<li>웜 분류 리샘플러 함수를 사용 하 여, 384-잘 접시 (384-잘 접시의 24-잘 접시 수익률 8-12 우물의 각 잘)의 각 음에 24-잘 플레이트 웜 정지에서 22 웜 정렬.<ol>
<li>정렬 전에 기아, 384-잘 접시 (OP50, 같은 음식, 전적으로 긴장 또는 병원 성 긴장)으로 피 펫 박테리아 방지를 위해. 참고: 병원 균은 2.3-2.5 또는 6.4 6.5 다음 단계 및 음식 소스 박테리아 그리고 희석 수 피 녹 농 균에 대해서 동일한 체계에 따라 추가 추가할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>후 웜 384-잘 접시에 정렬 되었습니다, 작은 분자 또는 다른 실험 관련 자료를 추가 합니다.</li>
</ol>6입니다. E. faecalis 에 대 한 적응
참고: 피 녹 농 균 분석 결과에서 차이만 설명 합니다.
<ol><li>BHI (두뇌 심 혼 주입) 한 천 배지 위에 냉동된 재고에서 박테리아를 질주 하 고 37 ° c.에 16 ~ 24 시간 배양 하 여 E. faecalis 의 신선한 소스 준비 참고: BSL-2 생물 안전 캐비닛 무 균을 보장 하기 위해 내부 E. faecalis 실험을 수행 합니다. 병원 성 감염 또는 오염 가능성을 최소화 하기 위해 적절 한 안전 조치를 사용 합니다.</li>
	<li>플레이트 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 이 기간 후 신선한 접시를 바꿉니다.</li>
	<li>웜, 정렬 하기 전에 밤 접종 3-5 mL의 단일 식민지와 살 균 BHI E. faecalis. 동요와 함께 37 ° C에서 12-16 h를 품 어.</li>
	<li>P. 녹 농 균 (3 x 박테리아에 S 기초, OD600≈0.09)에 관해서는 우물에 박테리아를 추가 합니다. 참고: E. faecalis, 최종 잘 구성입니다: E. faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 %v / v, 나머지 볼륨 S 기저의 구성. 기억 25 µ L S 기저의 벌레와 함께 전달 될 것 이다. 참고: E. faecalis 흐린된 이미지를 일으키는 형광 얼룩을 흡수 하는 두꺼운 biofilms를 생성 합니다. 광범위 한 세척이이 biofilm를 제거 하는 데 충분 하지 수 있습니다. 이 경우 웜 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 빈 접시를 전송할 수 있습니다. 촉진 하기 위해 전송, 트윈 20 0.1% (v/v) 트윈 20 S 기저에 최종 농도에 S 기저에 추가할 수 있습니다. 이 biofilm에서 벌레를 제거에 원조.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis,+causing+a+hypoxic+response+and+death.">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host &amp; Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li><li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content,+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence.">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li><li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis.">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li><li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis.">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li><li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection.">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion.">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li><li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds.">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

저자 들은 공개 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 분석 결과 (또는 다른 병원 체 피 농 균 또는 E. faecalis대체 됩니다 유사한 분석 실험)는 다양 한 약물 발견을 포함 하 여 목적에 대 한 유용 합니다. 그것은 또한 독성 요인, 호스트 방어 통로의 설명을 식별 하 고 호스트 병원 체 상호 작용에 관련 된 규제 기계를 확인 하 여 근본적인 생물학 질문을 해결 하는 데 유용.
P. 농 균 액체 죽이 분석 결과 강력한,...

식별 및 효과적인, 넓 스펙트럼 항생제의 개발 지금 거의 한 세기 전, 공중 보건에 분수령에 지도 되었다 대폭적인 신념 그 전염 성 질병 과거의 채찍 질 될 것 이라고. 짧은 몇 십년 내이 낙관론 병원 체 병원 체 개발이 한번 기적 치료 제한 저항 메커니즘 후로 지 러 지기 시작 했다. 몇 시간 동안, 약 발견 노력와 병원 체 사이 군비 경쟁 균형 잡힌 듯. 그러나, 항균의 오용은 최근 불러 팬-약물 내성 변종의 Klebsiella 균, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescens및 피 농 균1의 출현 2,,34.
P. 녹 농 균 은 편의적, 그램 네거티브, 멀티 호스트 병원 체 사람 immunocompromised, 또는 낭 성 섬유 증가지고 심한 화상 환자에 게 심각한 위협입니다. 그것은 또한 점점 더 심한 병원내 감염, 특히 항균 성 저항의 지속적인 인수 때문에 원인이 되는 대리인으로 식별 됩니다. 이 위협을 해결 하기 위해 시작, 우리는 문서화 C. 선 충-P. 녹 농 균 감염 시스템5를 사용 했습니다. 연구소는 호스트6죽 일 하는 병원 체의 기능을 제한 하는 새로운 화합물을 식별 하는 액체-기반, 높은 처리량, 높은 콘텐츠 심사 플랫폼을 개발 하는 것이 시스템을 활용 했다. 글에,이 화합물 제7 과 독성 억제제8을 포함 하 여 적어도 3 개의 일반적인 범주에 속하는 것 같다. C. 선 충 에서 다른 높은 콘텐츠 약물 발견 분석 진 균 tuberculosum, 클 라 미디 아 속 trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, 황색 포도상구균, 칸디 다 albicans, 보고 되었습니다 및 Enterococcus faecalis, 다른 사람의 사이에서9,10,11,12,13,14,,1516. 분석 실험의이 유형은 몇 가지 잘 인식된 장점이, 호스트와 병원 체, 화학 스크린과 넘어 안타를 식별 하는 기능에 비해 생체 이용률의 증가 가능성에 독성이 있을 수 있습니다 거짓 긍정적인 조회 수 제한 등 단순히 안티-virulents, 면역 물질로 분자, 또는 그렇지 않으면 전 찬성 호스트 병원 체 상호 작용의 균형을 기울일 화합물 등 미생물 성장을 제한. 또한,이 화면에서 발견 된 화합물은 종종 포유류 호스트에 효과적입니다.
그것은 적어도 두 개의 다른 분석 실험17,18 액체에서 C. 선 충 에서 높은 처리량 화면 수행 수 있습니다 지적 가치가 있다. 그러나,이 분석 실험은 원형 장 식민지 분석 결과, 액체에서 느린-살인로 알려진 있도록 수정 처리량을 증가 하 고 더 쉽게 상영 하는 화합물을 수 있도록. 주의 특성화는 결정적으로 세균 독성의 기계 장치는 이러한 분석 및 우리의 액체 기반의 화면7사이 설명 했다. 이후 두 가지 유형의 독성 포유류 시스템에서 관찰 된다, 그것은 어떤 독성 결정은 분석 결과 선택 이전 실험의 관심사에 대 한 가장 관련성이 높은 고려 하는 것이 중요.
여기 우리가 액체 기반으로 최적화 된 버전을 보여 농 균 선 충-P. C. 분석 결과. 우리는 또한 그람 양성 세균성 병원 체에 맞게 우리의 액체 기반의 분석 방법의 적응을 보고 Enterococcus faecalis. P. 녹 농 균, 같은 E. faecalis 점점 항균 성 저항 경로1의 성장 군비와 심각한 병원내 위협으로 식별 됩니다. E. faecalis 의 높은 처리량 검열에 대 한 이전 방법14존재, preinfection는 절차 복잡 하 고 COPAS FlowSort 같은 장비를 오염 하는 가능성을 증가 병원 체와 함께 필요 합니다. 우리의 프로토콜 안전 프로필 개선 사전 감염에 대 한 필요가 없다. 마지막으로, 우리는 이러한 분석 중 결합 될 수 있다 먹이의 설립에 있는 역할을 할 호스트 요소에 대 한 검색 사용자 수 있도록 RNAi 또는 감염에 저항 하는 수단을 보고 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>COPAS FP BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td>Large object flow cytometer/worm sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Pro</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Deep-Well RB Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>MPG-781091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Media (NGM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow Killing (SK) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter:&#160; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>L1520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>50-488-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Bleach Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S Basal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>S5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>P5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td>
			<td>BICCA</td>
			<td>7495.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-easy</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P. aeruginosa (PA14)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. faecalis(OG1RF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli superfood (OP50)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAi expressing bacteria (HT115)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

식별 하는 새로운 약물의 수에 의해 전통, 생체 외에서 스크린 쇠퇴 하고있다, 여러 약물 저항에 대처 하기 위해 새로운 무기에 대 한 검색에이 접근의 성공을 감소. 이 연구원은 새로운 약물을 찾는 데만 필요 하지 않습니다 하지만 또한 그들을 찾는 새로운 방법을 개발 해야 결론을 주도하 고 있다. 가장 유망한 후보자 사이 메서드는 전체 유기 체, vivo에서 분석 실험을 사용 하 여 높은 처리량, phenotypic 판독 Danio rerio 꼬마 선 충 에서 그 범위를 호스팅합니다. 이러한 호스트는 호스트 또는 biounavailable 독성 화합물을 일반적으로 비용이 많이 드는 따라 하기 전에 초기 화면에서 삭제 됩니다 거짓 긍정적인 안타에서 극적인 절감 등 여러 가지 강력한 이점이 있다.
여기에 우리가 어떻게 우리의 분석 결과 문서화 C. 선 충에서 호스트 변화를 심문 하는 데 사용 되었습니다 표시-녹 농 균 죽이 액체 pathosystem. 우리는 또한 잘 밖으로 일이 기술의 몇 가지 확장을 보여 줍니다. 예, 우리이 호스트 병원 체 상호 작용에서 쿼리 호스트 요인 플레이트 형식 높은 처리량 유전 스크린 24 또는 96 잘 RNAi를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 불과 몇 개월만에, 극적으로 힘 드는 생물 정화 방법에 대 한 필요 없이 잠재적으로 약물 표적을 식별 하는 작업을 단순화 수 있는 전체 게놈 스크린을 완료할 수 있습니다.
우리 또한 그람 양성 박테리아 Enterococcus faecalis 그람 음성 병원 체 피 녹 농 균에 대 한 대체 하는 우리의 방법의 변형 여기 보고 합니다. 많은 경우 처럼 피 녹 농 균에 대 한, E. faecalis 에 의해 죽이 시간 종속적입니다. 이전 선 충 C.달리-E. faecalis 분석 실험, 우리의 분석 결과 E. faecalis 팬 들은 preinfection의 정보 필요로 하지 않습니다, 그것의 안전 단면도 개선 및 액체 처리 장비를 오염 하는의 가능성을 감소. 분석 결과 매우 강력 하 고, ~ 95% 사망률 96 h 포스트 감염을 보여주는.

분석 결과 성능에 대 한 중요 한 매개 변수
이 분석 결과 기본 생물학에 대 한 적절 한 이해는 문제 해결 및 분석 결과 최적화 필요 합니다. 이 위해, 우리 몇 가지 주요 논문 elucidating P. 녹 농 균의 pathogenesis의 메커니즘에 먼저 참조-죽이 액체7,20중재. 위에서 설명 하는 ?...

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

14.4K 조회수.  Rice University. 여기 우리는 적응, 전체 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 신약 사용을 활용할 수 있는 도구를 높은 콘텐츠 심사 하는 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

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고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

표현형 높은 처리량 분석

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축

높은 처리량 유전자 태그에

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험