Name: a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
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Este estudo foi suportado pela prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (CPRIT) prêmio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e pelo nacional institutos de saúde K22 AI110552 atribuído a NVK. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Cuidado: P. aeruginosa e E. faecalis são patógenos de biossegurança nível 2, e devidas precauções de segurança devem ser tomadas para prevenir a infecção acidental e para minimizar a contaminação das superfícies. Todas as mídias e materiais que entram em contato com patógenos devem ser esterilizados e/ou descartadas. Orientações adicionais estão disponíveis a partir da publicação do CDC biossegurança em microbiológicas e laboratórios biomédicos (BMBL), 5ª edição.
1. preparação e manutenção de p. aeruginosa
<ol><li>Raia de p. aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB (lisogenia caldo). Incubar a 16 a 24 h a 37 ° C Nota: Realize experimentos de p. aeruginosa dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.</li>
	<li>Transferir essa placa para 4 ° C. Esta placa pode ser mantida a 4 ° C e utilizada para inocular culturas por até uma semana. Depois de uma semana, descontaminar e descartar a placa e fazer um novo prato de raia LB. Nota: A virulência de p. aeruginosa diminui após um armazenamento prolongado.</li>
	<li>Dois dias antes da criação de placas de ensaio, inocule 3-5 mL de caldo LB esterilizado com uma única colônia de p. aeruginosa da placa feita em 1.1. Incube a 37 ° C por 12 a 16 h. Nota: Não incube mais de 16 h. Em culturas de líquido ricas, p. aeruginosa PA14 começa a lyse.</li>
	<li>Preparar placas estéreis de 10 cm com mídia matar lenta (3G de NaCl, peptona de 3,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g/L). Nota: Prepare pratos antes do tempo. Eles podem ser armazenados por até 3 semanas em um recipiente hermético a 4 ° C.</li>
	<li>As sementes cada 10cm matar lenta placa (SK) com 350 μL de p. aeruginosa de cultura LB fresca durante a noite. Usando um difusor bacteriana estéril, equitativamente distribuídos por bactérias superfície da mídia e deixe-a secar em uma BSL-2 de segurança biológica.</li>
	<li>Incube as placas a 37 ° C por 24 h.</li>
</ol>2. preparação de bactérias de RNAi
<ol><li>Raia para fora ou desejada de pino-transferência cepas de bactérias contendo RNAi em placas de ágar LB contendo antibióticos apropriados (carbenicilina a 100 µ g/mL) e tetraciclina em 15 µ g/mL para Ahringer e Vidal bibliotecas de um estoque congelado. Nota: Quando se trabalha com bactérias não-patogênicas, use qualquer um A BSL-2 / B câmara de segurança biológica ou um fluxo laminar de BSL-1 capa para garantir a esterilidade das culturas e para minimizar a possibilidade de contaminação da biblioteca.</li>
	<li>Incubar as placas por 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Armazene as placas a 4 ° C por até duas semanas.<ol>
<li>Depois de duas semanas, descartar as placas e substituí-los com pratos feitos recentemente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste várias cepas de RNAi em paralelo, individualmente, inocular uma única colônia de cada clone em 4 mL de LB carbenicilina-completados em um único bem de uma placa de 24-bem profundo ou em um tubo de ensaio estéril. Nota: A tetraciclina tem sido relatada para reduzir a eficiência de RNAi. Não usá-lo nessa mídia.</li>
	<li>Coloque placas poço 24-poço profundo em uma incubadora tremendo otimizada para placas do multiwell e incubar a 37 ° C, durante 16 h agitando a 950 rpm. Nota: É difícil obter uniforme crescimento bacteriano em placas do multiwell usando uma incubadora tremendo convencional. A incubadora tremendo precisa ser capaz de abalar no mínimo de 750 rpm para que as culturas a crescer corretamente. Na ausência de um abanador especializado, é possível crescer cada cultura num tubo individual. Culturas podem ser transferidas para a placa de 24 para centrifugação depois, se desejado.</li>
	<li>Colete as bactérias por centrifugação por 5 minutos a 2.000 x g.</li>
	<li>Decante o sobrenadante por inverter a placa e agitação vigorosa. Resuspenda as bactérias de RNAi em 100 µ l de S Basal (5,85 g de NaCl, 1 g K2HPO4, 6g KH2PO4 dissolvido em 1 L de água ultrapura e esterilizados em autoclave).</li>
	<li>Pipetar ressuspensão de bactérias para um número adequado de poços de uma placa NGM do multiwell (nematódeo crescimento Media, 3 g de NaCl, peptona 2,5 g, 1 mM CaCl2, 1mm MgSO4, 25 mL de tampão fosfato (quantidade por litro: 132 mL de K2HPO4 (1 M) e 868 mL de KH2PO4 (1 M)) e ágar de 18 g por litro de água) suplementado com IPTG (concentração final de 1 mM) e carbenicilina (concentração final de 100 μg/mL).<ol>
<li>Use 3,5 mL de mídia NGM por alvéolo de placa de 6, 1 mL por bem de uma placa de 24 ou 150 µ l por poço da placa de 96 poços.</li>
		<li>Use 100 μL/poço de bactérias para a placa de 6; 50 μL/poço para 24-bem; ou 20 μL/poço para placa de 96 poços. Deixe-a secar. Nota: Secagem normalmente é executada em uma capa de fluxo estéril para promover a secagem rápida e uniforme. Secagem uniforme é muito importante. Evite o ressecamento, como rachaduras em agar promovem a construção de galerias de vermes. Isto leva a worm perdas e potencial de entupimento dos sistemas de tratamento de líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use as placas preparadas imediatamente ou armazená-los em 4 ° C por até duas semanas para uso posterior. Nota: Para impedir a secagem de placas, podem ser selados com filme plástico parafina ou colocados em um recipiente hermeticamente fechado com toalhas de papel húmido.</li>
</ol>3. manutenção e preparação de c. elegans
Nota: Antes de iniciar os experimentos, gere uma população sincronizada de vermes hermafroditas gravid, adultos como segue.
<ol><li>Lave adultos gravid (i.e., com múltiplos embriões visíveis dentro a gônada) de 4-6 chapas de NGM de 10 cm em um tubo cônico de 15 mL, adicionando-se 4 mL de S Basal a placa, agitando suavemente e em seguida despejando um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Granule vermes através de centrifugação a 1.000 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.</li>
	<li>Adicionar 3,5 mL de solução de lixívia worm (concentração final de 0.5M de NaOH, 1% de hipoclorito de sódio, em água estéril) para a pelota de worm e misture por inversão durante 1 minuto.</li>
	<li>Brevemente o vórtice e centrifugar a 1.000 x g por 30 segundos.</li>
	<li>Aspirar ou decante o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a pelota de verme.</li>
	<li>Adicione 3,5 mL de solução de lixívia fresca worm para a pelota de verme.</li>
	<li>Misture vigorosamente vermes em solução de água sanitária. Periodicamente (aproximadamente a cada dez segundos) Inspecione visualmente vermes sob um microscópio de dissecação. Cuidado com as cutículas worm quebrar, liberando ovos. Uma vez que a maioria dos vermes adultos foram dissolvidos (~ 95%), dilua água sanitária para 15 mL com S Basal para parar a digestão. Nota: As cascas de ovos são mais resistentes a lixívia que tecidos adultos, mas eles podem ser dissolvidos durante uma exposição prolongada. Para evitar a dissolução do ovo, não exponha os ovos para verme solução de água sanitária por mais de 7 minutos. Se as cascas de ovos são excessivamente danificadas, os embriões morrem.</li>
	<li>Pelota de embriões a 1.000 x g durante 30 segundos e aspirar ou decante o sobrenadante sem remover o sedimento de embriões.</li>
	<li>Resuspenda vermes em S basal até um volume final de 15 mL, diluir a solução de lixívia restantes.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem (3.9-3.10) três vezes mais para um total de 4 lavagens consecutivas.</li>
	<li>Após a quarta lavagem, aspirar o sobrenadante e adicionar até 5 ou 6 mL de estéril S Basal no tubo cônico de 15 mL. O objetivo é Resuspenda embriões para uma concentração de ~ 50 vermes por µ l. Nota: A quantidade de S Basal depende do tamanho da pelota ovo; Quanto maior a pelota, o mais Basal S é necessário.</li>
	<li>Incubar o tubo cônico durante a noite em um rotador mesa à temperatura ambiente ou 48 h a 15 ° C. As larvas eclodem, mas desenvolvimento larval vai prender na fase L1 (L1 diapausa) devido a privação de nutrientes.</li>
	<li>Examine os embriões sob um microscópio dissecação para verificar que a maioria deles têm eclodido e preso na fase do desenvolvimento de L1.</li>
	<li>Determine a contagem de verme tomando 20 µ l de prep worm e diluir com 80 µ l de S Basal. Pipete 10 µ l de solução diluída de worm diretamente na placa NGM vazia. Repita 2 vezes mais.<ol>
<li>Contar as larvas em cada local e determinar o número médio. Divida essa média por 2 para obter uma contagem aproximada de vermes por µ l em preparação o worm. Preparações do worm podem ser usadas para placas de propagação ou para experiências. Nota: Depois de 4-5 dias, larvas fome começará a morrer; Descarte o prep neste ponto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a propagação da estirpe, pipeta, um número adequado de vermes de L1 (5.000-6.000) nas chapas NGM 10cm 3-4 manchado com concentrado OP50 Escherichia coli – "superalimento" (e. coli OP50 manchado na concentração de X 25 (ou seja, 1 L de OP50 durante a noite cultura cultivada em LB produz 40 mL de 25 X OP50 superalimento); 2 mL da suspensão bacteriana concentrada são manchadas em cada placa NGM de 10 cm).</li>
	<li>Para preparar pratos para experimentos, faça o seguinte (para configuração de uso 3.17.1 "Protocolo básico", para as etapas de uso de "Tela de RNAi configurar" 3.17.2 - 3.17.4 conforme apropriado):<ol>
<li>Pipeta ~ 5.000 prato de vermes/10 cm semeado com RNAi ou OP50 superalimento.</li>
		<li>Pipeta ~ 500 vermes/poço em uma placa de 6 semeado com RNAi.</li>
		<li>Pipeta ~ 300 vermes/poço em uma placa de 24 semeado com RNAi.</li>
		<li>Pipetar 100 ~ vermes/poço em uma placa de 96 poços semeado com RNAi. Nota: Para obter instruções sobre como RNAi foi semeada por favor consulte os passos 2,7-2,9 na preparação de RNAi bactérias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se uma cepa fértil de vermes está sendo usada, incube vermes a 25 ° C ~ 44-48 h uso esses vermes tão rapidamente quanto possível após a população ter atingido a idade apropriada. Isso minimiza o impacto dos ovos para incubação dentro os vermes durante o ensaio.</li>
	<li>Se a tensão a ser utilizado é esterilizado a temperatura (por exemplo, fer-15(b26); FEM-1(hc17) ou glp-4(bn2)), incubar vermes a 15 ° C para ~ 16 h e depois transferir a 25 ° C, para 44 h completar o desenvolvimento e prevenir a embriogênese.</li>
</ol>4. líquido matando ensaio Setup (protocolo básico)
Nota: Este é um protocolo para uma estirpe bacteriana e uma fonte de vermes.
<ol><li>Com uma espátula de célula, remover a p. aeruginosa de uma placa de SK e Resuspenda em ~ 5ml de S Basal. Intensificar-se, se necessário. Medir a densidade óptica da suspensão bacteriana usando um espectrofotômetro (OD600)</li>
	<li>Prepare 24 mL de caldo diluído de p. aeruginosa em S Basal no OD600 ≈ 0,09% (concentração final X 3). Ver 4.6.2 para conteúdo final por alvéolo e dimensionar o volume de diluição bacteriana em conformidade.</li>
	<li>Adicione 21 mL de meio líquido matar lenta (3 g de NaCl, 3,5 g de peptona/L suplementado com CaCl2 e MgSO4 para uma concentração final de 1 mM). Usando uma pipeta multicanal, transferi 45 µ l de bactérias e de mídia para cada poço de uma placa de 384.</li>
	<li>Lave vermes de sua origem (ou seja, passo 3.17.1) em um tubo cónico de 50 mL e deixe vermes repousar sob a força gravitacional. Aspire o sobrenadante para 5 mL. Resuspenda em um total de 50 mL S basal.</li>
	<li>Repita a etapa 4.4 duas vezes.</li>
	<li>Usando um classificador de worm, classificar aproximadamente 22 vermes em cada poço da placa de 384 poços. Nota: A configuração gotas cada worm no ~1.1 µ l de líquido. 22 vermes ascenderá a 25 µ l, trazendo o volume total do ensaio a 70 µ l/poço.<ol>
<li>A composição final de cada poço é composto de 70 µ l µ l. 45 deste volume é adicionado como meio bacteriano (0,03 bactérias de600 OD em 24 µ l S Basal e 21 µ l SK suplementado com CaCl2 e MgSO4). Os outros 25 µ l é adicionado com os 22 vermes.</li>
		<li>Se o classificador usado aqui (veja a Tabela de materiais) está indisponível, vermes podem ser diluídos a uma concentração final de 1 worm / µ l em S Basal e pipetado 25 µ l/poço com uma pipeta multicanal. No entanto, os resultados podem apresentar maior variabilidade. Alternativamente, é possível usar um distribuidor de líquido peristáltico, conforme descrito por Leung e colegas19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, selar a placa com uma película permeável ao gás e incubar as placas a 25 ° C por 24-48 h.</li>
	<li>No momento desejado, use uma lavadora de microplacas para lavar a placa com S Basal de 384 um total de 5 vezes.<ol>
<li>Após a segunda lavagem, aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando ~ 20 µ l. vigorosamente sacode placas usando uma microplaca reaccional durante pelo menos 30 segundos para soltar todos os restos do fundo dos poços).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a lavagem final, aspirado sobrenadante até 20 µ l. Adicionar 50 µ l de 0,98 µM de ácidos nucleicos mancha (ver Tabela de materiais) / bem do prato 384-bem, para uma concentração final de 0,7 µM.</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente por 12-16 h. Esta tintura só vai manchar vermes mortos. Após o período de incubação desejado, lavar pratos usando a lavadora de microplacas para remover qualquer excesso mancham (um mínimo de 3 lavagens).</li>
	<li>Para aquisição de dados, use um espectrofotômetro ou um microscópio automatizado para imagem tanto luz transmitida e fluorescência (531 nm de excitação e emissão 593).<ol>
<li>Use um objectivo de baixa ampliação para permitir que uma imagem de todo bem a ser capturada.</li>
		<li>Como alternativa, use o fluxo vermimetry. Esta técnica usa um citômetro de fluxo de objeto grande, como um verme fluorímetro, medir o tamanho e a fluorescência de todo organismo (i.e., c. elegans) de uma forma que é fortemente semelhante a citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um software de análise automatizada de imagem (como CellProfiler, um estúdio de análise de imagem gratuito baseado no MatLab <a href="http://cellprofiler.org/">http://cellprofiler.org/</a>) para calcular as áreas de worm fluorescente e total por alvéolo de forma imparcial. Nota: O quociente entre esses números representa a morte de fração para cada poço. Se um bem tinha 7 manchado vermes fora de 20 total, então a morte de fração compreende 0,35 ou 35%.<ol>
<li>Antes da primeira utilização, o pipeline de processamento de imagens automatizado deve ser validado, marcando manual. Isto é feito comparando resultados do pipeline automatizado para escores obtidos visualmente inspecionando imagens e gravação de fracções de vermes mortos para cada um deles. O processo de validação garante que os parâmetros para o processamento de imagens automatizado são precisos e representam os dados corretamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. adaptação para estirpes múltiplas triagem c. elegans ou Knockdowns (RNAi tela Setup)
Nota: Esta é uma tela de RNAi descrita para uma configuração de placa 24.
<ol><li>Adicionar 1 mL de S Basal por bem de uma placa de 24 (consulte a etapa 3.17.3). Suavemente agitar vermes agitando a placa e, em seguida, transferir vermes para um vazio, estéril 24 profundo-placa. Permitir que vermes resolver gravitacionalmente (~ 5 minutos).</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando cerca de 1 mL. Adicione 7 mL de S Basal a cada poço.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.2 um mínimo de 2 vezes mais. Após a lavagem final, Aspire o sobrenadante, deixando aproximadamente 400 µ l.</li>
	<li>Usando a função Resampler do classificador de worm, classificar 22 vermes da suspensão do worm 24-placa em cada poço de uma placa de 384 (cada poço de uma placa 24 rendimentos 8-12 poços de uma placa de 384).<ol>
<li>Para evitar a fome, pipetar bactérias para placas boas 384 (uma tensão que serve apenas como alimento, tais como OP50, ou uma cepa patogênica) antes da classificação. Nota: Patógenos podem ser adicionados pelos seguintes etapas 2.3-2.5 ou 6.4-6.5 e fonte de alimento bactérias podem ser diluídas e adicionadas, seguindo o mesmo esquema de p. aeruginosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de vermes foram classificadas na placa de 384, adicione pequenas moléculas ou outros materiais específicos do experimento.</li>
</ol>6. adaptação de E. faecalis
Nota: Apenas as diferenças do ensaio de p. aeruginosa são descritas.
<ol><li>Prepare uma fonte fresca de E. faecalis , listando as bactérias de um estoque congelado em uma placa de ágar BHI (infusão de cérebro coração) e incubar durante 16 a 24 h a 37 ° C. Nota: Realize experimentos de E. faecalis dentro um BSL-2 de segurança biológica para assegurar a esterilidade. Use precauções de segurança adequadas para minimizar a chance de infecção patogénica ou contaminação.</li>
	<li>As placas podem ser armazenadas a 4 ° C por até uma semana. Após este período, substitua com um prato fresco.</li>
	<li>Na noite anterior classificação vermes, inocular 3-5 mL estéril BHI com uma única colônia de E. faecalis. Incube 12-16 h a 37 ° C, com agitação.</li>
	<li>Adicione bactérias nos poços quanto a p. aeruginosa (3 x bactérias S Basal, OD600≈0.09). Nota: Para o E. faecalis, a composição final do bem é: E. faecalis (OD ≈0.03 de600), BHI = 10% v/v, com o volume restante composto S basal. Lembre-se que 25 µ l de S basal será entregue com vermes. Nota: E. faecalis produz espessas biofilmes que absorvem o corante fluorescente, causando imagens borradas. Lavagem extensa pode ser insuficiente para remover o biofilme. Neste caso, os vermes podem ser transferidos para um prato vazio usando uma pipeta multicanal. Para facilitar a transferência, Tween 20 podem ser adicionados a S Basal para uma concentração final de 0,1% (v/v) Tween 20 em S Basal. Isso ajuda a retirar os vermes do biofilme.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae,+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections:+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients.">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li><li>Hsueh, P. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li><li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus.">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).</li><li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay.">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).</li><li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).</li><li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans.">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li><li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li><li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li><li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine,+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa,+translocates+into+C.+elegans,+removes+iron,+and+activates+a+distinct+host+response.">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa.">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).</li><li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model.">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li><li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation.">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li><li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans.">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li></ol>

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse a divulgar.

Este ensaio (ou ensaios semelhantes onde outros agentes patogénicos são substituídos por p. aeruginosa ou E. faecalis) são útil para uma variedade de finalidades, incluindo a descoberta de medicamentos. Também é útil para abordar questões biológicas fundamentais, tais como a identificação de fatores de virulência, a elucidação das vias de defesa do hospedeiro e determinando as máquinas reguladoras envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.
Embora o ensaio...

A identificação e o desenvolvimento de antibióticos de amplo espectro, eficazes, agora quase um século atrás, levaram a um momento decisivo na saúde pública onde havia uma crença generalizada que infecciosa doença seria um flagelo do passado. Dentro de poucas décadas, esse otimismo começou a diminuir, como patógeno após patógeno desenvolver mecanismos de resistência que limitado a esses tratamentos uma vez milagrosos. Há algum tempo, a corrida armamentista entre os esforços de descoberta de drogas e os patógenos parecia equilibrada. No entanto, o abuso de antimicrobianos recentemente culminou no surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pandrogas resistentes 2,3,4.
P. aeruginosa é um oportunista, gram negativos, vários hosts patógeno que é uma ameaça grave para os pacientes com queimaduras graves, aqueles que estão imunocomprometidos, ou tem fibrose cística. É também cada vez mais identificado como um agente causador de infecções nosocomiais graves, particularmente devido a sua aquisição em curso de resistência aos antimicrobianos. Para começar, para enfrentar esta ameaça, nós usamos o bem-documentado c. elegans-p. aeruginosa infecção sistema5. Nosso laboratório tem aproveitado este sistema para desenvolver uma plataforma baseada em líquido, alta produtividade, alto teor de rastreio para identificar novos compostos que limitam a capacidade do patógeno para matar o anfitrião6. Curiosamente, estes compostos parecem pertencer pelo menos três categorias gerais, incluindo antimicrobianos7 e virulência inibidores8. Outros ensaios de descoberta de drogas de alto teor em c. elegans foram relatados para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, entre outros9,10,11,12,13,14,15,16. Esses tipos de ensaios têm várias vantagens bem reconhecidas, como falsos positivos sucessos que podem ser tóxicos para o host e o patógeno, aumento da probabilidade de biodisponibilidade em comparação com uma tela de química e a capacidade de identificar sucessos além de limitar simplesmente limitar o crescimento microbiano, como anti-virulents, imunes estimulatórios moléculas ou compostos que caso contrário inclinar o equilíbrio da interação patógeno-hospedeiro em favor do antigo. Além disso, os compostos descobertos nessas telas são frequentemente eficazes em hospedeiros mamíferos.
É interessante notar que pelo menos dois outros ensaios17,18 estão disponíveis para realizar em telas de alta produtividade em c. elegans em líquido. No entanto, cada um destes ensaios é uma modificação que permite o ensaio de colonização intestinal protótipo, conhecido como lento-matança, a realizar-se em líquido, aumentando o throughput e permitindo compostos mais prontamente ser projectado. Caracterização cuidadosa demonstrou conclusivamente que os mecanismos de virulência bacteriana são diferentes entre estes ensaios e nossa tela baseada em líquido7. Desde que ambos os tipos de virulência são observados nos sistemas dos mamíferos, é importante considerar quais determinantes de virulência são mais relevante para os interesses do experimentador antes da seleção do ensaio.
Aqui demonstramos uma versão otimizada do líquido-baseado ensaio c. elegans-P. aeruginosa . Também relatamos a adaptação do nosso método de ensaio de líquido-baseado para acomodar o patógeno bacteriano Gram-positiva Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis é identificado cada vez mais como uma ameaça séria nosocomial com um armamento crescente de resistência antimicrobiana vias1. Embora um método anterior de seleção da elevado-produção de E. faecalis existe14, exige preinfection com o patógeno, o que complica o processo e aumenta a probabilidade de contaminação de equipamentos como o FlowSort COPAS. Nosso protocolo elimina a necessidade de pre-infecção, melhorando o perfil de segurança. Finalmente, nós relatamos um meio pelo qual um destes ensaios podem ser combinado com alimentação RNAi, permitindo que o usuário Pesquisar por fatores do hospedeiro que desempenham um papel no estabelecimento de, ou resistência à infecção.

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>Large object flow cytometer/worm sorter</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 Washer Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Deep-Well RB Block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384-Well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) plates</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Slow Killing (SK) media</td><td></td><td></td><td>Amount per liter:&amp;nbsp; 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M), 1 mL MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water</td></tr><tr><td>S Basal</td><td></td><td></td><td>Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 gram K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, and 1 Liter of milli-Q water</td></tr><tr><td>Agar</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffer</td><td></td><td></td><td>amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M)</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5% Sodium Hypochlorite Solution</td><td>BICCA</td><td>7495.5-32</td><td></td></tr><tr><td>NaOH solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-easy</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa &lt;/em&gt;(PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;superfood (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;RNAi expressing bacteria (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;glp-4&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;bn2&lt;/em&gt;) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-throughput, high-content, liquid-based c. elegans pathosystem

O número de novas drogas identificado pelo tradicional, telas em vitro tem diminuído, reduzindo o sucesso desta abordagem na busca de novas armas combater a resistência a múltiplas drogas. Isto levou à conclusão de que pesquisadores não só a necessidade de encontrar novas drogas, mas também precisam desenvolver novas formas de encontrá-los. Entre o candidato mais promissor métodos são todo-organismo, in vivo , os ensaios que uso elevado-throughput, fenotípicas leituras e hospeda que variam entre Caenorhabditis elegans Danio rerio. Esses hosts têm várias vantagens poderosas, incluindo grandes reduções no falsos positivos hits, como compostos que são tóxicos para o anfitrião e/ou biounavailable são tipicamente caiu na tela inicial, antes de seguir caro acima.
Aqui nós mostramos como nosso ensaio tem sido usado para interrogar a variação do anfitrião na bem documentada c. elegans— patossistema líquido da matança dePseudomonas aeruginosa . Também demonstramos várias extensões desta técnica bem trabalhado para fora. Por exemplo, somos capazes de realizar elevado-throughput genéticas telas usando RNAi em 24 - ou 96 poços placa formatos de fatores do hospedeiro consulta nessa interação patógeno-hospedeiro. Usando este ensaio, telas de genoma inteiro podem ser concluídas em poucos meses, que drasticamente podem simplificar a tarefa de identificar alvos de drogas, potencialmente sem a necessidade de abordagens de purificação bioquímica laborioso.
Também relatamos aqui uma variação do nosso método que substitui a Gram-positive bactéria Enterococcus faecalis para o patógeno gram-negativa p. aeruginosa. Muito, como é o caso de p. aeruginosa, matar por E. faecalis é dependente do tempo. Ao contrário do anterior c. elegans— ensaios deE. faecalis , nosso ensaio de E. faecalis não precisam preinfection, melhorar seu perfil de segurança e reduzindo as chances de contaminar o equipamento de tratamento de líquido. O ensaio é altamente robusto, apresentando infecção de post ~ 95% taxas de morte 96 h.

Parâmetros importantes para o desempenho
Uma compreensão adequada da biologia subjacente a este ensaio é necessária para a solução de problemas e otimizando o ensaio. Para o efeito, nos referimos primeiro vários papéis chaves elucidar os mecanismos de patogênese de p. aeruginosa-mediada matando em líquido7,20. Desde que as etapas descritas aci...

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A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genética

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neurociência

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biologia

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Imunologia e Infecção

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Resumo

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Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

A

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

C. elegans Chemotaxis Assay

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans