La presión constante dentro del dispositivo de fijación mantiene los pulmones en un estado razonablemente inflado generando una muestra pulmonar histológica adecuada para evaluar el enfisema inducido por el humo de cigarrillo leve. La principal ventaja de este modelo es que puede arreglar muchos pulmones al mismo tiempo utilizando la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación. Demostrando el procedimiento será Naoko Arano una estudiante graduada de mi laboratorio.
Después de confirmar una falta de respuesta al movimiento reflejo hacer una incisión en la piel y el tejido muscular a lo largo de la línea medial del ratón, apuntando a la región cefálica, y cortar lateralmente para crear un espacio de trabajo más amplio. Después de exponer la capa del diafragma, perfore el tejido con fórceps y abra el espacio torácico. Corte el área esternal permitiendo visualizar los pulmones y el corazón.
Y corta la aurícula izquierda y el ventrículo derecho. Inserte una cánula de calibre 24 conectada a una bomba de perfusión en el área del ventrículo derecho y dirija la cánula a la zona cefálica hasta que llegue a la arteria pulmonar. Luego, encienda la bomba y perfunda el tejido con aproximadamente 200 mililitros de PBS durante una hora hasta que todo el tejido pulmonar haya cambiado a un color blanco.
Al final de la perfusión cortar el tejido conectivo que rodea la tráquea, los pulmones y el corazón, y utilizar una sutura para atar el bronquio principal derecho. A continuación, cosecha todos los lóbulos individuales del pulmón derecho y coloca el corazón y los lóbulos del pulmón izquierdo en jeringas individuales de 10 mililitros que contengan un fijador adecuado. Retirar el émbolo creando un vacío en la jeringa para inflar los pulmones y extraer el pulmón de la jeringa.
Inserte una cánula de calibre 20 en la tráquea y use una sutura para asegurar la cánula en su lugar. Conecte una jeringa de un mililitro llena de fijador a la cánula y llene el pulmón con un fijador adicional para comprobar si hay fugas. Asegúrese de que el sitio de inserción esté asegurado para evitar que la muestra pulmonar se desprenda de la placa pulmonar durante la fijación.
Luego transfiera el tejido al equipo de presión de fijación pulmonar, extrayendo la muestra y atando la tráquea con un nudo al final del período de fijación. El componente inferior del equipo de presión de fijación pulmonar en el que se inserta la muestra pulmonar se conecta a través de la cánula de calibre 20 a la punta del flujo de formol con una llave de tres vías. La presión se genera a partir de los diferentes niveles de superficie del fijador entre los compartimentos inferior y superior.
La diferencia de presión es de 25 centímetros de agua, pero la perilla de ajuste de altura se puede utilizar para ajustar la presión a entre 25 y 30 centímetros de agua. Una bomba conecta los contenedores inferior y superior, conservando una diferencia de 25 centímetros en la altura de la superficie fijadora, y dirige el flujo del agente. Después de 48 horas de fijación, los pulmones de los ratones noqueadores SMP30 expuestos al aire ambiente no presentan un marcado agrandamiento del espacio aéreo.
Sin embargo, se observa un importante agrandamiento del espacio aéreo y destrucción de la pared alveolar en ratones knockout SMP30 expuestos al humo crónico del cigarrillo. Además, la intercepción lineal media y el índice destructivo de los especímenes pulmonares son significativamente mayores en los ratones knockout SMP30 expuestos al humo que en los animales expuestos al aire. Nuestro laboratorio utiliza 10% de formalina, pero los investigadores pueden utilizar otros agentes de fijación de acuerdo con sus necesidades experimentales.
Como hemos informado utilizando el sistema de fijación demostrado muestras pulmonares se pueden cosechar de varios modelos de enfisema de ratón para su evaluación morfométrica. Como los agentes de fijación pueden ser peligrosos, siempre use el equipo de protección del personal adecuado y trabaje en una habitación bien ventilada.
