Usando ratas, este protocolo se puede utilizar para establecer un nuevo modelo de la infección vih activa usando el VIH quimérico. con ratas, el establecimiento del modelo de infección por EcoHIV para estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos podría ser beneficioso para el estudio del neuro VIH y los trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1. La demostración del procedimiento será Hailong Li, un investigador asociado de mi laboratorio.
Para el envasado del virus en 293 células T, sembra de cinco veces 10 a la quinta 293 células T por mililitro de DMEM suplementado con 10% de FBS en cada uno de los dos frascos de 75 centímetros cuadrados recubiertos de gelatina e incubar las células a 37 grados centígrados hasta que los cultivos alcancen el 50% de confluencia. El día de la transfección, diluir 22,5 microlitros de reactivo de transfección en 750 microlitros de medio por matraz en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y vórtice la solución durante tres segundos. Diluir 20 microgramos del ADN quimérico del plásmido EcoHIV en 750 microlitros de medio en un segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por matraz con mezcla exhaustiva.
Combine el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido con una mezcla suave e incube la solución resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir cada suspensión de virus a 10 mililitros de medio DMEM de preguerra y añadir cada solución complementada por virus a un matraz de 293 células T. Después de dos días de cultivo celular, acoge el sobrenadante de los matraces en un solo tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación y transfiera el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo de 50 mililitros.
Agregue ocho mililitros de Lenti-X Concentrator al sobrenadante clarificado y mezcle con una inversión suave. Después de una incubación de dos días a cuatro grados Centígrados, centrífuga la mezcla y retire cuidadosamente el sobrenadante, luego resuspiente suavemente el pellet con 100 microlitros de PBS de 100 milimolares y use un kit P24 ELISA para diezmar la concentración del virus. Para la inyección ecoHIV-EGFP, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, afeite el cabello de la región cerebral y esterilice la piel expuesta dos veces con etanol al 70% y un exfoliante a base de clorhexidina.
Asegure la rata en una posición propensa en un aparato esteretáxico y haga una incisión de cinco a seis centímetros a través de la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Marque una posición de perforación a 0,8 milímetros de lateral y una rostral de 1,2 milímetros a bregma y perfore un agujero de 0,4 milímetros de diámetro en cada posición del cráneo. Cargue de 1,04 veces de 10 a las sextas unidades de transducción por mililitro de solución de Lentivirus EcoHIV titulada en una jeringa de inyección de 10 microlitros y asegure la jeringa al aparato estereotáxico.
Mueva la aguja cerca de la superficie de un orificio de perforación e inserte la aguja 2,5 mililitros en el orificio. Infunda un microlitro de solución de virus a una velocidad de 0,2 microlitros de virus por minuto. Cuando se haya inyectado todo el virus, deje la aguja dentro del área de inyección durante cinco minutos antes de retraer lentamente la aguja hasta que esté fuera del cráneo de la rata.
Cierre la incisión de la piel con una sutura de hilo de seda 4-0 y esterilice la solución con etanol al 70%, luego coloque a la rata en una cámara de recuperación con una almohadilla térmica con monitoreo hasta que recoste. De una a ocho semanas después de la infusión viral, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, fije la rata en una posición supina dentro de una campana extractora e incise la piel a lo largo de la línea media torácica. Corte el diafragma para abrir la cavidad torácica e inserte una aguja calibre 20 por 25 milímetros en el ventrículo izquierdo.
Abra inmediatamente la aurícula derecha con tijeras y perfunda 50 mililitros de PBS preenfriado de 100 milimolares a una velocidad de flujo de cinco mililitros por minuto. Cuando se haya entregado todo el PBS, perfundir con 100 mililitros de paraformadehído frío al 4%. Cuando se haya entregado todo el fijador, extraiga el cerebro del cráneo y fije el tejido durante la noche en paraformacionaldehído fresco al 4%.
A la mañana siguiente, coloque la muestra en 40 mililitros de sacarosa al 30% en PBS de 100 milimolares en un tubo de 50 mililitros durante aproximadamente tres días hasta que el cerebro se asiente en la parte inferior del tubo antes de congelar el tejido cerebral en butanol de metilo durante dos minutos a menos 80 grados Celsius. Después de congelar, use un criostato de menos 20 grados Celsius y un pincel fino para adquirir secciones coronales de 50 micras de espesor. Una vez obtenidas todas las secciones, cubra las muestras con 300 microlitros de medio antidesvanecimiento y montelas con 22 cubrebocas de 50 mililitros.
Cuando el medio se ha secado, imagen de las secciones por microscopía confocal. Siete días después de la inyección de Lentivirus, las imágenes de rebanadas cerebrales coronales de rata revelan una presencia significativa de señales ecoHIV-EGFP en todo el tejido cerebral, especialmente dentro de la corteza y la circunvolución dentada del hipocampo. El etiquetado dual con las sondas Iba1 y EcoHIV-EGFP proporciona una fuerte evidencia de que la microglía es el tipo de célula predominante que alberga la expresión de EcoHIV en el cerebro.
Ocho semanas después de la infección, EcoHIV inyectó animales exhiben una insensibilidad relativa a la manipulación del intervalo interestímulo como lo demuestra una función de intervalo relativamente más plana en comparación con los controles salinos. Además, las ratas inyectadas EcoHIV muestran alteraciones profundas en su morfología dendrítica de la espina dorsal según lo evidenciado por una frecuencia relativa creciente de espinas dendríticas más cortas con diámetros crecientes de la cabeza y del cuello en relación con animales de control. La concentración y titulación del medio de condición antes de la inyección estereotáxica es fundamental para garantizar los resultados consistentes y replicables en todos los experimentos.
Esta inyección estereotáxica regional específica de EcoHIV proporciona una infección eficiente por el VIH dentro del cerebro y produce déficits de procesamiento temporal en ratas. La utilización de inyecciones estereotáxicas contra el VIH en ratas para extender el modelo de infección por EcoHIV ofrece una oportunidad clave para abordar nuevas preguntas relacionadas con el neuro VIH en cuestión.
