Este protocolo describe cómo la combinación de la infección por EcoHIV con ratones Tmem119-EGFP ofrece un valioso sistema biológico para investigar las alteraciones microgliales y los reservorios virales en modelos de roedores con trastornos neurocognitivos asociados al VIH. La terapia antirretroviral combinada ha mejorado drásticamente la calidad de vida de las personas que viven con el VIH. Para comprender cómo afecta el VIH al sistema nervioso central, es necesario un modelo fiable y factible del VIH.
Anteriormente, se desarrolló un nuevo sistema biológico que utilizaba el VIH quimérico, EcoHIV en la colación, en un modelo de rata para investigar el deterioro neurocognitivo y la disfunción sináptica. Sigue habiendo un reto importante para aclarar la distribución neuroanatómica del EcoHIV, en particular su expresión diferencial en varios tipos de células del cerebro. En el estudio actual, EcoHIV con marcaje de fluorescencia mScarlet se modificó y se inyectó retroorbitalmente en ratones knock-in Tmem119-EGFP para determinar si la microglía es el principal tipo de célula responsable de la expresión viral y el reservorio del VIH en el cerebro.
Para comenzar, transfiera las células cerebrales fetales disociadas de rata a una placa de 12 pocillos prerrecubierta de poli-L-lisina con inserciones de vidrio que contienen un mililitro de DMEM-F12 más 10% de FBS. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio Neurobasal suplementado con B27 y continúe cultivando células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres semanas.
A continuación, añada 60 microlitros de EcoHIV-mScarlet en el cultivo de células cerebrales e incube durante seis días. Después de la incubación, fije las células con un 4% de paraformaldehído. Realice la inmunotinción en células cerebrales infectadas utilizando anticuerpos primarios específicos y obtenga imágenes de ellas en un microscopio confocal con un objetivo de 40x.
La microglía se identificó como el principal tipo de célula infectada en cultivos de células cerebrales de rata, como lo demuestra la colocalización de mScarlet con marcadores CD11b/c e Iba1. Para empezar, abra el cuero cabelludo de un ratón adulto decapitado y transfiera el tejido cerebral a otra placa de Petri que contenga cinco mililitros de HBSS esterilizado. Despegue las meninges y transfiera la corteza frontal a dos mililitros de HBSS.
A continuación, añade 20 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% a la mezcla. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente, agitando el tubo cada pocos minutos. Transfiera las células disociadas a un matraz de 75 centímetros cuadrados prerrecubierto de poli-L-lisina que contenga 10 mililitros de medio DMEM-F12 y 10% de FBS.
Cultive las células en una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen el 90% de confluencia. A continuación, digiere las células cerebrales con dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25%. Subcultive las células cerebrales digeridas en un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros que contiene cinco mililitros de medio de crecimiento DMEM-F12 hasta que alcancen el 80% de confluencia.
A continuación, añada ocho microlitros de EcoHIV-mScarlet en las células gliales del ratón e incube durante dos días. Las células gliales primarias de ratón adulto fueron infectadas con éxito por EcoHIV-mScarlet después de dos días de tratamiento. Para comenzar, asegure el ratón Tmem119-EGFP anestesiado en posición lateral.
Descongele el EcoHIV-mScarlet en hielo. Llene la solución viral en una jeringa inyectora intraocular con una aguja roma de calibre 33. Coloque el ratón en la decúbito lateral derecho con la cabeza hacia la izquierda.
Identifique el área de la inyección alrededor de la región del ojo. Inserte lenta y suavemente la aguja en el canto medial del ojo. A continuación, avance la aguja hacia los vasos detrás del globo ocular.
Inyecte 6,5 microlitros de EcoHIV-mScarlet en el seno retroorbitario. Después de la inyección, retire con cuidado la aguja. Coloque al ratón anestesiado en posición supina dentro de una campana de gases químicos.
Abra la piel a lo largo de la línea media torácica. A continuación, separa el diafragma y abre el cofre con unas tijeras. Ahora inserte una aguja y media de calibre 22 en el ventrículo izquierdo.
Abra la aurícula derecha con unas tijeras. Perfundir la aurícula derecha con 50 mililitros de PBS preenfriado de 100 milimolares, luego perfundir con 100 mililitros de paraformaldehído al 4% preenfriado. Retira todo el cerebro del ratón.
Después de fijar el cerebro en paraformaldehído al 4%, asegure el tejido cerebral con adhesivo para tejidos en la plataforma metálica del vibrátome. Corte secciones coronales de 50 micrómetros de espesor con cuchillas de acero al carbono. A continuación, coloque las rodajas de cerebro en portaobjetos de vidrio con un cepillo.
Agregue inmediatamente 0,1 mililitros de medio de montaje anti-decoloración a cada sección. Coloque un cubreobjetos de 22 por 50 milímetros sobre las secciones del cerebro y seque los portaobjetos Superfrost en la oscuridad durante un día. Al día siguiente, utilice un microscopio confocal con longitudes de onda de 488 nanómetros y 594 nanómetros para adquirir imágenes multicanal de la región cerebral de interés.
Las señales de EcoHIV-mScarlet se observaron principalmente en células microgliales marcadas con EGFP en el cerebro de ratón Tmem119-EGFP. No se detectó infección neuronal significativa en las células cerebrales de rata cultivadas tratadas con EcoHIV-mScarlet.
