Este procedimiento describe tres modelos de ratones inmunodeficientes humanizados para el estudio de la dinámica de la infección por VIH. Los ratones humanizados NSG recapitulan las características de la inmunidad humana. En este caso, permitir el estudio de la infección por VIH crónica, aguda y reactivada en entornos preclínicos.
Demostrando el procedimiento de preparación celular estará Sandra Medina-Moreno, una supervisora de investigación de laboratorio de nuestro grupo. Al realizar este procedimiento, utilice siempre equipos de protección personal desechables que incluyan exfoliantes estériles, guantes, zapatos dedicados, fundas de zapatos, máscara, gafas, gorros para el cabello y la barba, y una capa de laboratorio estéril. Para el modelo crónico, resuspendir un millón de células madre humanas CD34+congeladas en 10 mililitros de medios RPMI 1640 con 10%FBS bajo un gabinete de bioseguridad certificado y mantener condiciones estériles.
Utilice 10 microlitros de la suspensión para contar y comprobar la viabilidad celular mediante la tinción de exclusión de Trypan Blue en un hemociclometro. A continuación, centrifugar la suspensión de la célula a 400 veces g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en frío 1X PBS a la concentración requerida.
Mantenga las células sobre hielo hasta la inyección. Frote la ropa de cama limpia entre las manos para enmascarar cualquier otro olor extraño en los cachorros receptores. A continuación, coloque los cachorros en un plato estéril de 100 milímetros cuadrados de Petri junto con una pequeña cantidad de material de cama de la jaula del criador.
Ponga el plato Petri en una jaula de transporte limpia y luego coloque la jaula en una jaula de transporte de Carboy para proteger a los cachorros de la luz directa y el ruido. Cubra la jaula de transporte con una almohadilla de cubierta para evitar la exposición de los animales al medio ambiente mientras están en tránsito a la sala de irradiación. Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, preparar para el injerto a través de la inyección hepática.
Para minimizar el tiempo de restricción del ratón, deje que un investigador cargue la jeringa con la suspensión de la célula madre y que el segundo investigador sostenga al cachorro y administre la inyección. Cargue 50 microlitros de la suspensión de células madre humanas CD34+ en la jeringa con una aguja conectada debajo del gabinete de bioseguridad certificado. Restringir a los cachorros con el pulgar y los dedos índice y limpiar el lugar de inyección con 70%alcohol.
Utilice un ángulo de aguja poco profundo para entregar 50 microlitros de células directamente en el hígado para no perforar completamente el hígado. Precalienta el plato usando una almohadilla de calentamiento infrarrojo para roedores a 20 grados Celsius para asegurar que los cachorros no estén demasiado calentados. Coloque a los cachorros en el plato de Petri cubierto con gasa estéril durante uno a cinco minutos para permitir la recuperación.
Inmediatamente antes de devolver los cachorros a sus padres, aplicar una pequeña cantidad de mentol y pomada a base de eucalipto usando el pulgar y los dedos índice al hocico de ambos padres para evitar el canibalismo o el rechazo de los cachorros. Revise las jaulas todos los días y busque cualquier signo de injerto frente a enfermedad del huésped en los cachorros, como piel seca, sin alimentación, erupción cutánea o alopecia. Desteta a los cachorros a las tres semanas de edad y los alberga en diferentes jaulas.
Verifique el injerto en la sangre periférica por citometría de flujo a las 14 semanas de edad. Se muestra una estrategia representativa para la evaluación de la reconstrucción humana de células CD45+cell y el porcentaje de células CD4+ y CD8+T. La tasa de éxito del injerto es de entre el 80% y el 100%Uso de células mononucleares de sangre periférica humana derivadas de un donante sano para el modelo agudo o de un paciente infectado por el VIH que estaba bajo tratamiento antirretroviral para el modelo de reactivación.
Capa 15 mililitros de sangre entera en cinco mililitros de densidad estéril gradiente medio en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin roturas para evitar que la capa de buffy se mezcle con el medio de gradiente de densidad. Recoja cuidadosamente la fracción de células mononucleares entre el medio de gradiente de densidad y el sobrenadante.
Transfiera la capa buffy a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 1X PBS. Centrifugar a 300 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y retire los glóbulos rojos restantes mediante la eliminación con cinco mililitros de tónidor de lelisis ACK añadidos a las células peletadas.
Incubar durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar de nuevo como antes, deseche el sobrenadante y resuspend en 10 mililitros de 1X PBS o RPMI 1640 medio. Utilice 10 microlitros de la suspensión celular para contar las células y comprobar la viabilidad mediante la tinción de exclusión de Trypan Blue en un hemocitoómetro.
Típicamente, se obtienen de uno a dos millones de células por cada mililitro de sangre con más del 95% de viabilidad. Después de la centrifugación como antes, deseche el sobrenadante y ajuste el número de celda a la concentración requerida. Cargue 3,5 millones de células mononucleares de sangre periférica en 200 microlitros de 1X PBS en una jeringa con una aguja conectada debajo de un gabinete de bioseguridad certificado.
Retire el ratón de la jaula y sosténgalo junto a la cola para que pueda agarrar la malla aplicando una suave tracción hacia atrás. A continuación, coloque el dedo índice y el pulgar en los hombros del animal agarrando la piel suelta del cuello y usando el dedo medio para estabilizar su espalda. Deslice la cabeza del ratón hacia atrás para que su espalda esté por encima de su cabeza.
Esto permite que las vísceras de la cavidad abdominal se desplacen hacia atrás y reduce el riesgo de perforar los órganos internos durante la inyección. Limpie el lugar de inyección con 70%alcohol. Penetra la jeringa preparada a través de la pared abdominal y aspira antes de inyectar las células.
Si se aspira algún material, retire la jeringa y deséchela. De lo contrario, inyecte las células lentamente en la cavidad intraperitoneal antes de extraer la jeringa y descartarla. Devolver al animal a su jaula y verificar el injerto en la sangre periférica por citometría de flujo a las tres semanas después de la inyección.
Identifique los ratones mediante el etiquetado de oídos. Observe de cerca los ratones utilizados en estos experimentos, dos veces al día después de cada procedimiento para detectar signos clínicos de angustia. A continuación, proceda a la inyección de VIH como se describe en el protocolo de texto.
Después de la inyección del VIH, hay un rápido aumento de la carga viral plasmática que generalmente es detectable después de dos a tres semanas después de la infección en los modelos crónicos y agudos con cinética similar en el modelo de reactivación. El aumento de la carga viral coincide con una disminución de la relación CD4:CD8. Estos cambios no se observan en ratones de control.
Cabe destacar que en el modelo de ratón adulto PBMC NSG humanizado, se observa una inversión inicial de la relación CD4:CD8 y se reconstituye a lo largo del tiempo de monitoreo. Cuando se administra tratamiento antirretroviral a ratones infectados por el VIH, se produjo una supresión de la carga viral, así como la recuperación en la relación CD4:CD8 según lo previsto, alcanzando niveles similares a los de los controles no infectados. Típicamente, después de dos a tres semanas de tratamiento, se observa una disminución en la carga viral y un aumento en la relación CD4:CD8 en los modelos crónicos, agudos y de reactivación.
Utilice la dosis de irradiación recomendada para evitar una sobredosis letal o el rechazo de las células trasplantadas. No perfore completamente el hígado durante la inyección y use ropa de cama para enmascarar los olores que la presa percibirá como extraños. Estos tres modelos permiten la prueba de compuestos antivirales, anticuerpos anti-VIH u otras sustancias biológicas que afectan la replicación viral.
Además, permiten experimentos de transferencia adaptativa para la inmunoterapia contra el VIH. Los ratones humanizados NSG pueden reconstituirse parcialmente o en su totalidad con células humanas para responder a patógenos o fármacos, imitando la complejidad del sistema inmunitario humano. Todas las medidas biológicas básicas deben seguirse estrictamente, ya que los ratones humanizados NSG pueden infectarse con patógenos murino y humanos, particularmente en este caso que utiliza la manipulación del virus del VIH.
