Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la fisiopatología de la aterosclerosis temprana en ratones. La principal ventaja de esta técnica es la eficiencia, rapidez con la que la aldosterona induce el desarrollo de placas de aterosclerosis en el crecimiento adulto. La demostración visual de este método es fundamental, ya que algunos pasos técnicos son difíciles de aprender solo a través de la instrucción de texto.
Demostrando el procedimiento estará Caterina Mammi, una científica del personal de mi laboratorio. Usando guantes quirúrgicos, conecte el tubo de llenado de la minibobo bomba a una jeringa de un mililitro y cargue el tubo con 125 microlitros de la solución de aldosterona o vehículo. Inserte el tubo de llenado a través del orificio en la parte superior de la minibobo bomba hasta que no pueda avanzar más y llenar lentamente la bomba con la solución de aldosterona.
Deje de llenar la bomba cuando salga un cordón de líquido del cuerpo de la bomba y retire cuidadosamente el tubo de llenado. Inserte el regulador de flujo en el cuerpo de la minibobo bomba, teniendo cuidado de que el regulador se desbanque firmemente contra el cuerpo de la bomba y inserte la bomba llena en un vaso de precipitados que contenga solución salina estéril a 37 grados centígrados, hasta 24 horas antes de la implantación. Para implantar las bombas, utilice una maquinilla de afeitar para extraer el cabello del sitio quirúrgico y desinfectar la piel expuesta con un 70%de material de almohadilla empapada de alcohol isopropílico y no tejido.
A continuación, haga una incisión de 0,8 a un centímetro a través de la piel, pero no los tejidos subyacentes y use fórceps para abrir la incisión. Usando un trocar en la otra mano, extienda la piel para crear un bolsillo para la bomba de la incisión hacia la escápula e inserte la bomba en la incisión, con la cabeza del regulador orientada hacia la parte delantera del ratón, empujando suavemente la bomba completamente en el bolsillo para que haya suficiente piel para cerrar la herida sin tensión ni estiramiento. Una vez insertada la bomba, suturar la incisión con alambre de cirugía y utilizar un hisopo limpio para aplicar pomada de yodo tópica, 10%povidona.
A continuación, permita que el ratón se recupere en una etapa de calentamiento con monitoreo hasta la recumbencia completa. En el punto final experimental apropiado, perfunda el ratón a través del ventrículo izquierdo utilizando perfusión por gravedad con 10 a 15 mililitros de DPBS helado, seguido de 40 a 50 mililitros del 10% de la formulación amortiguada neutra. Después de 10 a 20 minutos, coloque el ratón bajo un microscopio estéreo y use fórceps y tijeras para eliminar el exceso de tejido adiposo periartico y pericárdico.
Sostenga el corazón fijo con fórceps y corte perpendicularmente al acceso del arco aórtico, lo más cerca posible del corazón, sin causar daño. Una vez que el corazón se ha separado de la aorta, utilice un bisturí para cortar transversalmente a lo largo de una línea recta, uniendo los puntos inferiores de la aurícula derecha e izquierda y llenar la parte superior del corazón abierto con un compuesto de temperatura de corte óptimo. Coloque el tejido resecado con un molde de plástico crio-sección con el eje de la aorta colocado perpendicularmente a la base del molde rectangular y cubra el tejido con OCT fresco.
Retroiluminar el molde para asegurarse de que el tejido está correctamente orientado, a continuación, colocar cuidadosamente el molde en una placa de metal sobre hielo seco, envolviendo todo el molde con papel de plata para menos 80 grados Celsius almacenamiento cuando el OCT se vuelve blanco. Cuando la crioestleta alcance menos 20 grados Celsius, monte el bloqueo cardíaco congelado en el soporte de la muestra con el ventricular orientado hacia afuera e inserte el soporte de la muestra en la cabeza orientadora de la muestra. Ajuste la orientación del soporte de la muestra para sedear el bloque con la raíz aórtica perpendicular a la hoja y corte el bloque hasta que se alcance la raíz aórtica.
Recoger secciones seriales en portaobjetos de vidrio, monitoreando el perfil anatómico de raíz aórtica, hasta que aparezcan las tres válvulas aórticas. A continuación, recoja secciones de seis a ocho, 10 micrómetros de espesor o hasta que una de las tres válvulas desaparezca o ya no esté intacta. Para la tinción de grasa neutra O roja en color rojo aceite, fije las secciones en 70 mililitros de 37%formaldehído durante cinco minutos, seguido de un lavado a fondo en agua del grifo.
Después de dos a tres minutos, borre el agua de acceso y manche las secciones en 70 mililitros de 0,3% de aceite rojo O durante 10 minutos. Al final de la incubación, lave los portaobjetos en agua del grifo durante 10 minutos y manche las células durante un minuto en 70 mililitros de hematoxilina de Meyer, seguido de un lavado de agua de un minuto y una emersión de un minuto en 70 mililitros de 0,5% de carbonato de litio. A continuación, lave las células en agua durante un último minuto y monte las secciones con un medio de montaje acuoso para la toma de imágenes mediante microscopía ligera.
Después de cuatro semanas de tratamiento, los ratones knockout de apolipoproteína-E mostraron un aumento significativo en el contenido de lípidos, en comparación con los animales de tipo salvaje de control. Además, el tratamiento con aldosterona aumenta el contenido de macrófagos en los animales noqueadores, como lo demuestra la tinción de mack-3 e indica una placa aterosclerótica más inflamada en estos animales en comparación con los ratones tratados con vehículos. Sin embargo, el tratamiento con aldosterona no altera el contenido de colágeno de las placas ateroscleróticas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este método se valida sólo para ratones apolipoproteína que son naturalmente propensos a desarrollar aterosclerosis cuando se alimentan de un tinte aterogénico. Por lo tanto, no puede aplicarse a diferentes modelos animales. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inframanchas para caracterizar la aterosclerosis en otra región aórtica y cuantificar el total de la carga aterosclerótica.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la aterosclerosis exploraran el mecanismo temprano de la aterogénesis, como la inflamación y la disfunción endotelial. No olvide que trabajar con compuestos volátiles como el isófano y la formalina puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como el uso de máscara facial de laboratorio de seguridad siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
