Este método puede ayudar a abordar preguntas relacionadas con la eficiencia, el rendimiento de recuperación y la pureza de las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar utilizando un enfoque de centrifugación de ultrafiltración. Comparamos directamente esta técnica con una técnica de purificación de gradiente de ultracentrifugación y densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es simple, eficiente y adecuada para muestras de pequeño volumen como el líquido de lavado broncoalveolar murino.
Lo que es más importante, proporciona alta pureza y escalabilidad significativamente mayor en comparación con un método de aislamiento de ultracentrifugación. Norman Garrett III, investigador asociado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte un angiocatéter calibre 22 en la tráquea de un ratón eutanizado.
Coloque una jeringa de insulina con un mililitro de DPBS estéril con frío helado e incultre un mililitro en ambos pulmones. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar el líquido de lavado broncoalveolar o líquido BAL. Y dispensar el líquido BAL en un tubo cónico sobre hielo.
Después de esto, tire del líquido BAL de 25 ratones y divídalo en dos conjuntos iguales. Centrifugar el líquido BAL a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoger el sobrenadante y centrifugarlo a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, recoja el sobrenadante y proceda a los pasos de aislamiento EV inmediatamente. En primer lugar, filtre el súper natant a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 micrómetros. Después de esto, equilibre la unidad de filtro centrífuga con DPBS estéril durante 10 minutos.
Luego centrifuga la unidad centrífuga a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Llene el filtro con 15 mililitros de líquido BAL. Y centrifugarlo a 3.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de esto, lave el retentate con 14 mililitros de DPBS estériles pipeteando suavemente repetidamente. Centrifugar la unidad de filtro a 3.000 G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para retirar el DPBS y concentrar el retentato. Para recoger los EV derivados del fluido BAL concentrado, inserte una pipeta en la parte inferior de la unidad de filtro y retire la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado.
A continuación, aliquot el líquido BAL derivado EV's y almacenarlos en menos 80 grados celsius. Alternativamente, comience transfiriendo el sobrenadante adquirido anterior a un tubo de ultracentrífuga. Y centrifugarlo a 10.000 G por 30 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, recoger el sobrenadante y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet EV en 200 microlitros de DPBS. Después de esto, mezcle la suspensión EV con 300 microlitros de solución de trabajo 50%iodixanol.
Y transfiéralo a un tubo ultracentrífugo de 15 mililitros. A continuación, agregue la solución de búfer de acuerdo con el protocolo de texto para crear un gradiente de densidad boyante y centrifúelo a 100.000 G durante tres horas y 50 minutos. Recoger el 15% y el 25%fracciones de iodixanol, y diluirlos en DPBS para llevar el volumen hasta 15 mililitros.
Transfiera las fracciones a un nuevo tubo de ultracentrífuga y centrifugar a 100.000 G a cuatro grados centígrados durante 60 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets EV en 50 microlitros de DPBS estériles. Para comenzar el análisis de seguimiento de nanopartículas, diluya la muestra EV en un mililitro de DPBS.
Y cargue la muestra en una jeringa de insulina. Después de esto, conecte la jeringa a una bomba de jeringa y mida los números y el tamaño de las partículas. Establezca el nivel de la cámara en 14 y el umbral de detección en uno.
A continuación, utilice un lector de placas para cuantificar la cantidad de proteína en la muestra EV mediante la detección colorimétrica. Disolver una cantidad igual de proteína EV de cada muestra con un tampón de carga de hinchazón y TDT. A continuación, caliente las muestras a 70 grados centígrados durante 10 minutos.
Cargue las muestras en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus y ejecute la electroforesis durante 35 minutos. A continuación, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando un método de transferencia en seco. Después de esto, bloquear la membrana con cinco por ciento de leche desnatada durante 60 minutos con suave balanceo.
Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína superficial EV a cuatro grados centígrados con un suave balanceo durante la noche. Desarrollar la membrana incubando la membrana con anticuerpo de enlace HRP durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave la membrana durante 10 minutos con el tampón TBST tres veces.
Por último, desarrolle la membrana con reactivo quimiominiscente de detección de anticuerpos HRP antes de proceder a la toma de imágenes. Para comenzar la citometría de flujo, diluir los EV derivados del fluido BAL en 49 microlitros de tampón de tinción PEB. Luego agregue tres anticuerpos a cada una de las muestras, antes de incubar las muestras a cuatro grados centígrados con balanceo durante 60 minutos en la oscuridad.
Por último, diluir las muestras con 40 microlitros de tampón de tinción PEB filtrada por membrana y realizar análisis de citometría de flujo. En este protocolo, los EV fueron aislados del fluido BAL del ratón usando un método UFC y UC-DGC. Los EV derivados del fluido BAL de ratones normales aislados por el método UFC mostraban tamaños más pequeños y una distribución de tamaño más uniforme que las uc-DGC-EV.
La técnica UFC también tuvo un recuento total de partículas significativamente mayor en comparación con la técnica UC-DGC. La recuperación total de proteínas medida en miligramos de UFC-EV también fue mayor que la de la UC-DGC-EV, lo que indica que la técnica de UFC es más eficiente en tiempo y esfuerzo. Finalmente, los EV derivados del fluido BAL también se caracterizaron aún más a través de la citometría de flujo.
Los UFC-EV y UC-DGC-EV expresaron CD63, CD9 y CD81. Al intentar este procedimiento, es importante recordar rehidratar la membrana de la unidad de ultrafiltración con DPBS. Una vez que la membrana está hidratada, la unidad debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que se utilice.
Recuperar el retentato de vesícula extracelular de la unidad de filtro puede ser un desafío. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté barrida de lado a lado para recuperar la mayor parte de los EV de la unidad de filtro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del aislamiento de vesícula extracelular exploraran las funciones biológicas del lavado broncoalveolar derivado de vesículas extracelulares derivadas tanto en condiciones normales como patológicas en animales pequeños.
