Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como cómo afectan las interacciones de la matriz celular al sulfato. La principal ventaja de esta técnica es que genera el primer material que refleja con precisión los microambientes bioquímicos de la corteza renal nativa. Forrar una capucha de cultivo de tejido con una almohadilla inferior.
Coloque un vaso de precipitados de un litro que contenga una barra de agitación, un plato de cultivo de tejido estéril de 150 milímetros y todo el riñón en la capucha. Llene el vaso de precipitados con 500 mililitros de solución 1%SDS. Coloque el riñón en el plato de cultivo de tejido estéril.
Retire toda la grasa perirenal afeitando ligeramente alrededor de la cápsula renal con un bisturí. Luego, haga una incisión superficial de ocho a 10 centímetros a través del extremo superior del riñón, para romper la cápsula renal sin dañar el tejido de la corteza subyacente. Utilice dos abrazaderas de hemostat para extraer la cápsula renal despegándola del tejido de la corteza.
Bisect el riñón a lo largo del plano coronal mediante el uso del bisturí a lo largo del lado lateral del riñón. Aísle el tejido de la corteza de ambas mitades tallando la región medullar con el bisturí. Luego, corta el tejido de la corteza en trozos en cubos de 0,5 centímetros, y retira cualquier vaso grande y visible.
Para aislar la matriz extracelular del riñón, coloque el tejido de la corteza cortada en cubos en el vaso de precipitados que contiene la solución SDS. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio autoclave y colóquelo en una placa de agitación a aproximadamente 400 RPM, fuera de la capucha de cultivo de tejido. Después de 24 horas de agitación, lleve el vaso de precipitados a una capucha de cultivo de tejido.
Añade un colador celular estéril de 40 micras hecho con malla de nylon. Y luego, llene un vaso de precipitados separado de 1000 mililitros con 200 mililitros de lejía, y colóquelo en la capucha de cultivo de tejido. Deseche la solución SDS a través del colador celular, en el vaso de precipitados que contiene lejía.
Pipet out any remaining SDS solution, until only decellularized tissue and cell strainer remain in the beaker. Deje el colador celular en el vaso de precipitados y agregue 500 mililitros de solución SDS fresca. Cubra el vaso de precipitados con la misma lámina de aluminio y colóquelo en una placa de agitación a la misma velocidad que antes.
Después de la descelularización y el lavado, transfiera el tejido descelularizado, conocido como ECM renal a partir de este momento, a un tubo cónico autónomo de 30 mililitros. Y llénalo con agua de grado de cultivo celular, hasta que todo el tejido esté sumergido. En primer lugar, utilice un homogeneizador de tejido para homogeneizar el ECM renal en el tubo cónico durante dos minutos, hasta obtener una solución opaca sin piezas visibles de ECM.
Luego, sumerja el tubo cónico que contiene el ECM renal en nitrógeno líquido hasta que la ebullición que rodea el tubo ya no persista. Almacene el ECM renal a menos cuatro grados centígrados durante la noche. Para liofilizar el tejido descelularizado congelado, afloje ligeramente la tapa cónica del tubo para permitir el intercambio de gas, y coloque el tubo en una máquina de liofilización.
Liofilizar el ECM renal durante tres días, o hasta que se asemeja a un polvo blanco fino. Para digerir y solubilizar químicamente el gel, agregue la pepsina gástrica porcina cuidadosamente pesada y el ácido clorhídrico normal 0.01 a una vil de centelleo que contenga una barra de agitación. Revuelva a aproximadamente 500 RPM, hasta que toda la pepsina se haya disuelto.
Luego, transfiera el ECM renal liofilizado a la centelleo vil y deje la solución en una placa de agitación a aproximadamente 500 RPM durante tres días para hacer el hidrogel ECM riñón de stock. En una campana de cultivo de tejido, pipetear los volúmenes requeridos de medios de cultivo celular, un hidróxido de sodio normal y suplemento M199, en un tubo cónico estéril de 30 mililitros auto-standing. Mezclar la solución de reactivo neutralizante con una micro espátula.
Utilice una jeringa estéril de un mililitro para transferir el volumen adecuado de hidrogel ECM renal a la solución de reactivo neutralizante. Utilice una micro espátula para mezclar suavemente la solución hasta obtener una solución homogénea de color hidrogel. Evite introducir burbujas de aire revolviendo lentamente y suavemente.
Para incorporar células en el hidrogel ECM renal, resuspendir trescientas mil células en 10 microlitros de medio para cada hidrogel. Pipet 10 microlitros de suspensión celular en el gel ECM renal final. Revuelva la solución con una micro espátula hasta que las células se distribuyan uniformemente.
Utilice una jeringa de un mililitro para llenar el dispositivo de cultivo celular deseado con el hidrogel ECM renal. Deje que el gel se ajuste a 37 grados Celsius durante una hora antes de transferir o enchapar las células en el ECM renal en el dispositivo de cultivo celular. El análisis del tejido de la corteza descelularizada por espectrometría de masas, reveló la presencia de proteínas asociadas a la lámina de albahaca, siendo colágeno-IV y colágeno-I el más representado.
Se conservaron las cadenas colágeno-IV, A1 y A2, omnipresentes en todas las membranas del sótano. También se detectaron cadenas de colágeno-IV, A3 y A5, presentes sólo en membranas del sótano del glomerulo. También se detectaron formas iso comunes de Laminins y Colágeno-I.
Las células endoteliales microvasculares peritubulares renales humanas, o HKMECs, cultivadas en colágeno-I, ECM renal y un gel de mezcla 1:1, mostraron diferencias en el fenotipo. HKMECs cultivados en Colágeno-I, muestran una expresión CD31 uniforme, vista en rojo. Mientras que las HKMEC cultivadas en los dos geles que contienen ECM renal, mostraron una expresión reducida de CD31 en distribuciones desiguales.
El tipo de matriz no parecía afectar a la expresión VWF, que se muestra en verde. Al intentar este procedimiento, es importante recordar homogeneizar completamente el tejido de la corteza renal descelularizada. Además, al mezclar el gel con reactivos neutralizantes, evitar la introducción de burbujas de aire.
Los sistemas fisiológicos micro permiten el estudio de la función del órgano en un entorno de laboratorio controlado. La creación de estos sistemas requiere la implementación de células, matrices y estímulos. El hidrogel kECM fabricado aquí, nos permitirá estudiar estos sistemas que recapitulan los microambientes renales.
