Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, например, как взаимодействие клеточной матрицы влияет на сульфат. Основным преимуществом этого метода является то, что он генерирует первый материал, который точно отражает родной биохимической микросреду коры почек. Линия ткани культуры капот с под площадку.
Поместите один литр стакана, содержащего перемешать бар, 150 миллиметров стерильных тканей культуры блюдо, и вся почка в капюшон. Заполните стакан 500 миллилитров 1%SDS решения. Поместите почку в стерильную ткань культуры блюдо.
Удалите весь поменный жир, слегка бритья вокруг почечной капсулы скальпелем. Затем сделайте неглубокий разрез на 8-10 сантиметров через верхний конец почки, чтобы открыть почечную капсулу, не повреждая ткани коры головного мозга. Используйте два зажима гемостата, чтобы удалить почечную капсулу, очистив ее от ткани коры головного мозга.
Раздразьте почку вдоль корональной плоскости с помощью скальпеля вдоль боковой стороны почки. Изолировать ткани коры от обеих половин, вырезая область medullar скальпелем. Затем нарежьте ткани коры головного мозга кубиками на 0,5 сантиметра кубиками и удалите любые крупные видимые сосуды.
Чтобы изолировать внеклеточную матрицу от почки, поместите нарезанную кубиками ткань коры в стакан, содержащий раствор SDS. Обложка стакан с autoclaved алюминиевой фольги и поместите его на пластину перемешать около 400 об /мин, за пределами ткани культуры капот. После 24 часов перемешивания, довести стакан в ткань культуры капюшон.
Добавьте 40 микрон стерильный клеточный ситечко, изготовленную из нейлоновой сетки. А затем заполните отдельный стакан в 1000 миллилитров 200 миллилитров отбеливателя и поместите его в капюшон культуры тканей. Утилизировать раствор SDS через клеточный ситечко, в стакан, содержащий отбеливатель.
Труба из любого оставшегося раствора SDS, пока только decellularized ткани и клетки ситечко остаются в стакане. Оставьте клеточный ситечко в стакане и добавьте 500 миллилитров свежего раствора SDS. Обложка стакан с той же алюминиевой фольгой, и место на пластину перемешать с той же скоростью, как и раньше.
После децеллюляризации и мытья перенесите децеллюляризованную ткань, именуемую ЭКМ почек с этого момента, в 30-миллилитровую самопозвященную коническую трубку. И заполните его водой класса клеточной культуры, пока вся ткань не будет погружена в воду. Во-первых, используйте гомогенизатор тканей для гомогенизации почек ECM в конической трубке в течение двух минут, пока непрозрачный раствор без видимых частей ECM не будет получен.
Затем погрузите коническую трубку, содержащую ЭКМ почки, в жидкий азот до кипения, окружающего трубку, больше не сохраняется. Храните почки ECM при минус четырех градусах по Цельсию на ночь. Чтобы лиофилизировать замороженные децеллюляризованные ткани, слегка ослабить коническую крышку трубки, чтобы обеспечить обмен газа, и поместить трубку в лиофилизацию машины.
Лиофилизировать почки ECM в течение трех дней, или пока он не напоминает штраф, белый порошок. Чтобы химически переварить и solubilize гель, добавить тщательно взвешенный свиной желудочный пепсин, и 0,01 нормальной соляной кислоты сцинтилляции мерзкий содержащие перемешать бар. Перемешать при 500 об/мин, пока весь пепсин не растворился.
Затем перенесите лиофилинированную почку ЭКМ в мерзкий сцинтилляцион и оставьте раствор на пластине перемешивания при примерно 500 об/мин в течение трех дней, чтобы сделать запас почки ECM гидрогелем. В капюшоне культуры ткани, трубчатые необходимые объемы средств культуры клетки, одного нормального гидроксида натрия и дополнения M199, в стерильную 30 миллилитров self-standing коническую пробку. Смешайте нейтрализующий раствор реагента с помощью микро шпателя.
Используйте стерильный одноми миллилитровый шприц для переноса соответствующего объема стокового гидрогеля почки ECM в нейтрализующий раствор реагента. Используйте микро шпатель, чтобы аккуратно смешать раствор до однородного цвета, гидрогель решение получено. Избегайте введения пузырьков воздуха, помешивая медленно и осторожно.
Для включения клеток в гидрогель ЭКМ почки, перерасход триста тысяч клеток в 10 микролитров среды для каждого гидрогеля. Пипетка 10 микролитров клеточной подвески в окончательный гель ECM почки. Перемешать раствор с помощью микро шпателя до тех пор, пока клетки равномерно распределены.
Используйте один миллилитровый шприц, чтобы заполнить желаемое устройство культуры клеток с гидрогелем ECM почки. Разрешить гель установить на 37 градусов по Цельсию в течение одного часа перед передачей или покрытием клеток на почки ECM в устройстве культуры клеток. Анализ децеллюляризованной ткани коры по масс-спектрометрии, выявил наличие белков, связанных с базиликом ламина, с коллагеном-IV и коллагеном-I является наиболее высоко представлены.
Были сохранены цепи коллагена-IV, А1 и А2, повсеместные во всех мембранах подвала. Также были обнаружены цепи Коллаген-IV, А3 и А5, присутствующие только в подвальных мембранах гломерула. Общие формы изо ламининов и коллагена-я также были обнаружены.
Человеческие почки перитубулярных микрососудистых эндотелиальных клеток, или HKMECs, культурные на коллаген-I, почки ECM, и 1:1 смесь гель, показали различия в фенотипе. HKMECs, культурные на коллагене-I, отображаются равномерное выражение CD31, увиденное красным цветом. В то время как HKMECs культурировался на двух гелях, содержащих ECM почек, отображается уменьшенное выражение CD31 в неравномерных распределениях.
Тип матрицы, по-видимому, не влияет на выражение VWF, показанное зеленым цветом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы полностью гомогенизировать децеллюляризованной ткани коры почек. Кроме того, при смешивании геля с нейтрализуя реагентами избегайте введения пузырьков воздуха.
Микро физиологические системы позволяют изучать функцию органов в контролируемой лабораторной обстановке. Создание таких систем требует внедрения клеток, матриц и стимулов. КЕСМ гидрогель, изготовленный здесь, позволит нам изучить такие системы, которые подыкают микросреду почек.
