이 방법은 세포 매트릭스 상호 작용이 황산염에 미치는 영향과 같은 생체 재료 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 토착 신장 피질 생화학 미생물 환경을 정확하게 반영하는 첫 번째 물질을 생성한다는 것입니다. 언더 패드와 조직 배양 후드를 라인.
교반 바, 150mm 멸균 조직 배양 접시, 신장 전체를 후드에 넣습니다. 1% SDS 솔루션의 500 밀리리터로 비커를 채웁니다. 멸균 조직 배양 접시에 신장을 놓습니다.
메스로 신장 캡슐 주위를 가볍게 면도하여 모든 페리신 지방을 제거합니다. 그런 다음, 신장의 우수한 끝에 걸쳐 얕은 8 ~10 센티미터 절개를, 기본 피질 조직을 손상시키지 않고 신장 캡슐을 열어 깰. 두 개의 혈우염 클램프를 사용하여 피질 조직에서 벗겨내어 신장 캡슐을 제거하십시오.
신장의 측면을 따라 메스를 사용하여 관상 평면을 따라 신장을 양분하십시오. 메스와 함께 수질 부위를 조각하여 두 반쪽에서 피질 조직을 분리합니다. 그런 다음 피질 조직을 0.5 센티미터 큐브 조각으로 주사위와 크고 보이는 혈관을 제거하십시오.
신장에서 세포외 매트릭스를 격리하려면, SDS 용액을 포함하는 비커에 다진 피질 조직을 배치합니다. 비커를 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮고 조직 배양 후드 바깥쪽에 있는 약 400RPM의 교반판에 놓습니다. 24 시간 의 교반 후, 조직 배양 후드에 비커를 가져.
나일론 메쉬로 만든 40 마이크론 멸균 셀 스트레이너를 추가합니다. 그리고, 표백제 200 밀리리터와 별도의 1000 밀리리터 비커를 채우고, 조직 배양 후드에 놓습니다. 세포 스트레이너를 통해 SDS 용액을 표백제가 들어있는 비커에 넣습니다.
남은 SDS 용액을 제거하면 세포 변형 조직과 세포 스트레이너만 비커에 남아 있을 때까지 피펫합니다. 비커에 셀 스트레이너를 두고 500 밀리리터의 신선한 SDS 솔루션을 추가합니다. 비커를 동일한 알루미늄 호일로 덮고 이전과 같은 속도로 저어줍니다.
탈세포화 및 세척 후, 이 시점부터 신장 ECM이라고 불리는 탈세포화된 조직을 30밀리리터 자가형 원내 튜브로 옮킨다. 그리고 모든 조직이 물에 잠길 때까지 세포 배양 등급의 물로 채웁니다. 먼저, 조직 균질화제를 사용하여 원문 관내 신장 ECM을 2분 동안 균질화하고, 눈에 보이는 ECM 조각이 없는 불투명한 용액을 얻을 수 있다.
이어서, 액체 질소에 신장 ECM을 함유하는 원내관을 침수하여 튜브를 둘러싼 끓는 것이 더 이상 지속되지 않습니다. 신장 ECM을 하룻밤 동안 영하 4도에 보관하십시오. 동결 된 탈세포 조직을 lyophilize하려면, 약간 가스 교환을 허용하기 위해 원문 튜브 캡을 느슨하게하고, lyophilization 기계에 튜브를 배치합니다.
3 일 동안 신장 ECM을 lyophilize, 또는 그것은 미세, 흰색 분말을 닮은 때까지. 젤을 화학적으로 소화하고 용해시키기 위해 조심스럽게 계량된 돼지 위 펩신과 0.01 일반 염산에 교반 바를 함유한 신경에 첨가합니다. 약 500 RPM에서 저어주면 모든 펩신이 용해될 때까지 저어줍니다.
이어서, 리오필화된 신장 ECM을 신설성멸으로 옮기고 약 500RPM에서 3일 동안 용액을 교반판에 남겨두고 혈중 신장 ECM 하이드로겔을 만든다. 조직 배양 후드에서, 세포 배양 매체의 필요한 볼륨, 하나의 정상적인 수산화 나트륨 및 M199 보충, 멸균 30 밀리 리터 자체 서 원뿔 튜브로 파이프. 중화 시약 용액을 마이크로 주걱과 혼합합니다.
멸균 1 밀리리터 주사기를 사용하여 적절한 양의 스톡 신장 ECM 하이드로겔을 중화 시약 용액으로 이송합니다. 마이크로 주걱을 사용하여 균일한 색상, 하이드로겔 용액이 얻어질 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다. 천천히 부드럽게 저어서 기포를 도입하지 마십시오.
신장 ECM 하이드로겔에 세포를 통합하기 위해, 각 하이드로겔에 대한 배지의 10 마이크로 리터에 삼십만 세포를 다시 중단. 최종 신장 ECM 젤로 세포 현탁액의 파이프 10 마이크로 리터. 세포가 균등하게 분포될 때까지 마이크로 주걱으로 용액을 저어줍니다.
1 밀리리터 주사기를 사용하여 원하는 세포 배양 장치를 신장 ECM 하이드로겔로 채웁니다. 젤이 세포 배양 장치에서 신장 ECM에 세포를 옮기거나 도금하기 전에 1 시간 동안 섭씨 37도에서 설정되도록 하십시오. 질량 분석법에 의한 탈세포 피질 조직의 분석은, 콜라겐-IV와 콜라겐-I가 가장 높게 표현되는 바질 라미나와 관련되었던 단백질의 존재를 밝혔습니다.
콜라겐-IV, A1 및 A2 체인, 모든 지하 막에 유비쿼터스 보존 되었다. 콜로메루스의 지하 막에만 존재하는 콜라겐-IV, A3 및 A5 체인도 검출되었다. 라민과 콜라겐-I의 일반적인 이소 형태도 검출되었습니다.
인간 신장 관피 미생물 세포, 또는 HKMECs, 콜라겐-I, 신장 ECM 및 1:1 혼합물 젤에 배양, 표현형에 있는 다름을 보였다. 콜라겐-I에서 배양된 HKMECs는 빨간색으로 보이는 균일한 CD31 표현을 표시했습니다. HKMEC는 신장 ECM을 포함하는 2개의 젤에 배양하는 동안, 고르지 않은 분포에서 감소된 CD31 발현을 표시했습니다.
매트릭스 유형은 녹색으로 표시된 VWF 식에 영향을 미치지 않았습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 완전히 탈세포 신장 피질 조직을 균질화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 중화 시약과 젤을 혼합 할 때, 기포의 도입을 피하십시오.
마이크로 생리 시스템은 통제 된 실험실 환경에서 장기 기능의 연구를 허용합니다. 이러한 시스템의 생성은 세포, 행렬 및 자극의 구현이 필요합니다. 여기서 제작된 kECM 하이드로겔은 신장 마이크로 환경을 재구성하는 시스템을 연구할 수 있게 해줍니다.
