Este protocolo permite una determinación precisa de la duración de la fase S en células de levadura en gemación sincronizadas. Es un método rápido, fácil y reproducible. Además, es lo suficientemente sensible como para detectar defectos de síntesis leves no detectados por los protocolos clásicos.
Este método será útil para muchos investigadores que trabajan en la regulación del ciclo celular en levaduras en ciernes. Demostrando este protocolo estarán Nicolás Talarek, investigador principal, y Juan De Dios Barba Tena, estudiante de doctorado en el laboratorio. Inocular células de Saccharomyces cerevisiae en 10 mililitros de medio SC a una concentración celular baja para un cultivo nocturno a 30 grados centígrados con agitación orbital a 130 rotaciones por minuto.
Al día siguiente, diluir las células en 20 mililitros de medio SC fresco a una concentración final de dos a tres veces 10 a las seis células por mililitro. A 40 microlitros de un miligramo por mililitro de factor alfa diluido en agua. Luego cultive las células a 30 grados centígrados, con agitación orbital a 130 rotaciones por minuto durante una hora.
Repita este paso una vez. Visualice las células bajo un microscopio de luz para monitorear la detención de G1. Proceda si más del 90% de las celdas muestran un shmoo, y las otras son células redondeadas sin tope.
Centrifugar las muestras durante tres minutos a 1.500 G.A continuación, desechar el sobrenadante con la pipeta de vacío y resuspender las células en 20 mililitros de medio SC. Repita este paso una vez. Recoja un mililitro de células dos veces cada cinco minutos y proceda al etiquetado de EDU.
Agregue 400 microlitros del factor alfa 30 minutos después de la liberación. Transfiera un mililitro del cultivo celular a un tubo de microfuga de dos mililitros que contenga un microlitro de EDU 10 milimolar, mezclado bien por inversión. Para discriminar las células EDU positivas de las células EDU negativas en un Pi EDU bivariante, transfiera otro mililitro de cultivo celular a un tubo de microfuga de dos mililitros que contenga un microlitro de DMSO.
Incubar durante tres a cinco minutos a 30 grados centígrados bajo agitación en un baño de agua agitado. Detenga la reacción agregando 100 microlitros de etanol al 100%. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microfuga.
Retire el sobrenadante con una pipeta de vacío. Resuspender el pellet celular en 500 microlitros de etanol al 70% y mezclar bien mediante vórtice. Deje las muestras a temperatura ambiente durante al menos una hora a 20 inclinaciones por minuto en un balancín de velocidad variable para permeabilizar las células.
Granular las células durante dos minutos a 10.000 g en una microcentrífuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío. Lave las células dos veces con 500 microlitros de etanol al 10% y PBS. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microfuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío.
Resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS que contienen RNasa A y proteinasa K.Incubar de una a dos horas a 50 grados centígrados con agitación ocasional, o durante la noche a 37 grados centígrados. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microcentrífuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío. Lave las células con 500 microlitros de PBS.
Luego pellet las células y deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente. Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS con 1% BSA. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego pellet las células, deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente y resuspenda el pellet en 300 microlitros de PBS que contienen 1% de BSA. Distribuya las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. El primero debe consistir en 200 microlitros de cultivo celular para la reacción Click, y el segundo tubo debe contener 100 microlitros de cultivo celular para la tinción verde sytox.
Luego, granular las células y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Para la tinción verde sytox, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de PBS. Luego, dependiendo de la concentración celular, transfiera de 10 a 30 microlitros a un tubo de citómetro de flujo que contenga 300 microlitros de la mezcla verde sytox.
Sonicar las muestras dos veces durante dos segundos a una amplitud de 40 a 50%Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro de flujo. Para la reacción Click, resuspenda el pellet celular con 40 microlitros de tampón de colorante Azide recién preparado. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 minutos.
Granular las células y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Luego lave las células tres veces con 300 microlitros de etanol al 10% en PBS. A continuación, resuspender las células en 100 microlitros de 50 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en PBS y dejar durante 10 minutos en la oscuridad.
Dependiendo de la concentración celular, transfiera de 10 a 30 microlitros de la suspensión celular a un tubo de citómetro de flujo que contenga 300 microlitros de 50 milimolares Tris HCl, pH 7.5. Sonicate dos veces durante dos segundos a una amplitud de 40 a 50. Deje las muestras en la oscuridad hasta que las procese en un citómetro.
Lea las muestras de sytox green usando un láser azul de excitación a 488 nanómetros y un filtro de paso de banda de 530 por 30. Lea las muestras de Bavaria Pi EDU en un diagrama de puntos utilizando un láser azul de excitación a 488 nanómetros y un filtro de paso de banda de 615 por 20 para el eje X Pi, y un láser de excitación rojo a 640 nanómetros, un filtro de paso de banda de 660 por 20 para el eje Y. Se observaron tres poblaciones de células en el análisis bivariante del citómetro EDU Pi.
A 25 grados centígrados, aproximadamente el 27% de la población celular estaba en la fase G1, el 29% estaba en la fase S y aproximadamente el 44% estaba en la fase G2 más M. En las células sincronizadas, la duración de la fase S puede ser de unos 25 minutos en función del momento en que el contenido de ADN cambió de un C a dos C en el perfil del citómetro de flujo verde sytox. El etiquetado de pulsos EDU determinó con precisión la duración de la fase S.
15 minutos después de la liberación, se detectó una fracción de células EDU positivas, lo que indica el inicio de la fase S. La progresión a través de la fase S fue vista por la nube celular moviéndose hacia arriba y hacia la derecha en el gráfico EDU de Bavaria Pi. Finalmente, a los 35 minutos de la liberación, una fracción de células fue EDU negativa, pero con el doble de la cantidad de ADN que indica que la fase S terminó y las células estaban en la fase G2 más M.
A pesar de la alta sincronía observada, algunas células terminaron la fase S 60 minutos después de la liberación y la fase S se completó para toda la población aproximadamente 65 minutos después de la liberación. Es crucial tener una sincronización perfecta y evitar que las células entren en la segunda fase S. Las células pueden ser fotografiadas con un microscopio donde la previsión de replicación del ADN nuclear puede ser monitoreada y cuantificada.
Esta técnica ayudará a identificar mutantes pasados por alto que tienen defectos leves de la fase S, así como defectos de duración del ciclo celular.
