Este método emplea la aplicación tópica de nanopartículas para la imagen de tumores microscópicos, especialmente en neoplasias malignas que aún no tienen acceso a la vasculatura, como la metástasis del cáncer de ovario. Esta técnica es nanopartículas ratiométricas, dirigidas por imágenes y no dirigidas en una sola exploración para disminuir las señales falsas y revelar la verdadera extensión del tumor. Estas nanopartículas se pueden administrar mediante inyección intraperitoneal o intravenosa para obtener imágenes de alta precisión del cáncer de ovario y muchos otros tipos de tumores.
Para la síntesis de núcleo nanostar de oro coloque un matraz cónico que contenga 800 mililitros de solución de ácido ascórbico recién preparada en una placa de agitación magnética a cuatro grados celsius e induzca un vórtice constante. Añadir rápidamente ocho mililitros de solución de ácido tetracloroaurico recién preparada al vórtice. En cuestión de segundos se formarán nanoestrellas y la solución asumirá un color azul oscuro.
Vierta la suspensión nanostar en tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugación y aspire todos los microlitros de sobrenadantes de cada tubo al final del giro. Utilice una micropipeta para resuspender las nanopartículas de cada tubo antes de agrupar todas las nanopartículas en un solo casezo de diálisis. A continuación, dializar las nanopartículas durante al menos tres días contra dos litros de agua desionizada cambiando el agua diariamente.
Para la formación de cáscara de sílice, primero añadir 10 mililitros de isopropanol, 500 microlitros de TEOS, 200 microlitros de agua desionizada, y 60 microlitros de tinte a un tubo cónico de 50 mililitros. Y añadir tres mililitros de etanol, y 200 microlitros de hidróxido de amonio a un tubo de 15 mililitros. A continuación, sonicar las nanollamitas dializadas para dispersar cualquier racimo y añadir 1,2 mililitros de nanollamistas al tubo.
Coloque el tubo de 50 mililitros en un mezclador de vórtice e induzca un vórtice constante. Agregue rápidamente la solución nanostar al tubo de 50 mililitros con unos cinco segundos más de mezcla antes de transferir rápidamente el tubo a una coctelera durante 15 minutos a 300 RPM a temperatura ambiente. Los dos tubos deben combinarse rápidamente y bajo un nixing constante para garantizar que la reacción de silicación ocurra en las nanoestrellas y para minimizar la producción libre de sílice.
Al final de la incubación llenar el tubo con etanol para apagar la reacción y recoger las nanollamidades por centrifugación. Aspirar todos menos sobre los últimos 500 microlitros de sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el pellet y resuspender las nanopartículas en un mililitro de etanol fresco. A continuación, transfiera la solución a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros para cuatro mililitros de lavados de etanol por centrifugación, resuspendiendo el pellet por ultrasonidos durante aproximadamente un segundo entre cada lavado.
Para introducir tioles en las superficies de las partículas, después del último lavado resuspendó el pellet en un mililitro de un 85%etanol, 10%3-mercaptopropyl-trimethoxysilane, y 5% solución de agua desionizada para una incubación de una a dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las nanopartículas funcionalizadas tiol por centrifugación como se indica, resuspendiendo el pellet por ultrasonidos entre lavados. Para los anticuerpos funcionalizados anti-folato receptor nanosondas reaccionan 200 microgramos de anticuerpos proteicos de unión anti-folato con exceso molar tenún de enlace transversal PEG en 500 microlitros de tampón HEPES.
Después de 30 minutos concentrar el anticuerpo por centrifugación en un filtro centrífugo, recuperando el anticuerpo invirtiendo el filtro en un nuevo tubo para una centrifugación adicional. A continuación, mezcle las nanopartículas funcionalizadas de tiol con el anticuerpo concentrado e incubar la mezcla durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Para formar nano sondas no dirigidas, añada cinco miligramos de metásiide PEG 5000 maleimidos disueltos en DMSO a las nanopartículas funcionalizadas con tiol en 500 microlitros de tampón HEPES para una incubación de al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
Para la inyección de nanosonda girar hacia abajo ambos sabores de nanosonda y resuspender los pellets en tampón MES fresco a una concentración picomolar 600. Mezclar las nanopartículas y cargar un mililitro de la solución resultante en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 por ratón e inyectar por vía intraperitoneal todo el volumen en el abdomen de cada ratón. Luego masajee suavemente el abdomen para distribuir las nanopartículas por toda la cavidad peritoneal.
Después de al menos 25 minutos, asegure las extremidades de un animal inyectado eutanizado en una plataforma quirúrgica y use fórceps serrados y tijeras de disección para extraer la piel y exponer el peritoneo. Incite el peritoneo. Fije los aletas peritoneales a la plataforma y lave el interior de la cavidad peritoneal con al menos 60 mililitros de PBS.
A continuación, transfiera la plataforma a un espectrofotómetro Raman con una configuración óptica vertical y una etapa motorizada e imagen del abdomen bajo los parámetros de imagen adecuados. Esto es crucial que el plano focal para la exploración de Raman esté en la superficie de la mayoría de las vísceras. Si los órganos están fuera de plano, la señal adquirida no será útil.
Para fines de control de calidad, las nanopartículas se pueden caracterizar utilizando una variedad de métodos durante el proceso de síntesis, incluyendo microscopía electrónica de transmisión, dispersión dinámica de luz, análisis de seguimiento de nanopartículas y espectroscopia absorbente visible ultravioleta. Las mediciones de Raman revelan la presencia de los espectros únicos de cada sabor de nanopartículas a lo largo de la síntesis. Los rendimientos y concentraciones de reacción típicos dependen en gran medida de la técnica de pipeteo durante los pasos de lavado.
Los espectros Raman se pueden procesar para eliminar la fluorescencia y normalizarse al área de la unidad para compensar la intensidad de la señal antes de aplicar los cuadrados mínimos clásicos. Aunque las puntuaciones clásicas menos cuadradas en cada espectro de referencia de nanosonda no proporcionan individualmente las ubicaciones específicas de los tumores, las proporciones puntuales revelan la presencia de la propagación microscópica diseminada. Al intentar este procedimiento es importante recordar validar las nanopartículas en cada paso de la síntesis, ya que la calidad de las nanopartículas afecta fuertemente a los resultados finales.
Esta técnica demuestra el potencial de los investigadores para utilizar nano sondas SERRS para la detección de marcadores relacionados con tumores en modelos animales y tejidos de pacientes extirpados con un alto grado de precisión microscópica.
