Las medidas de detección clínica de cáncer de ovario actuales son inespecíficas y carecen de detección de punto de atención de las células tumorales circulantes. Nuestro sistema de flujo fotoacústico permite analizar muestras de pacientes en busca de marcadores específicos de cáncer de ovario en el torrente sanguíneo. Este procedimiento proporciona una tecnología de plataforma única con mejoras sobre las técnicas actuales en términos de simplicidad, bajo costo, límites prometedores de detección y capacidad para ser aplicado a aplicaciones amplias.
A través de este trabajo, nuestro objetivo es construir a partir de nuestro sistema de nanopartículas dirigido para el cáncer de ovario para probar muestras de pacientes ex vivo para los CTC. Este sistema PAFC altamente versátil es capaz de expandirse para uso clínico, probando la presencia de una amplia gama de biomarcadores en la sangre. La alineación óptica adecuada es fundamental para la detección de objetivos dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.
Además, para garantizar un acoplamiento acústico adecuado, asegúrese de que no haya burbujas entre el portaobjetos de vidrio y el transductor. Debido a la naturaleza personalizada del sistema de flujo y sus componentes, la visualización del método es beneficiosa para una reproducción precisa. En una campana de humos química ventilada, filtre aproximadamente 300 mililitros de agua desionizada a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros.
Agregue 0,0134 gramos de cloruro de cobre y 100 mililitros de agua desionizada a un matraz de fondo redondo limpio de 250 mililitros para crear una solución de cloruro de cobre de un milimolar. Añadir 0,015 gramos de ácido fólico al matraz y utilizar una barra de agitación magnética para mezclar la solución durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, mezcle 0,024 gramos de sulfuro de sodio nonahidrato con 100 microlitros de agua desionizada.
Utilice una pipeta de 200 microlitios para añadir lentamente esta solución a la mezcla de reacción durante una duración de aproximadamente 10 segundos. Tapa la nave de reacción. Coloque el recipiente en un baño de aceite a 90 grados Centígrados y continúe revolviendo.
Después de aproximadamente 15 minutos o cuando el baño de aceite ha alcanzado el rango de temperatura entre 85 y 90 grados Celsius, permita que la reacción continúe durante una hora adicional. Una vez completada la reacción, retire el recipiente de reacción del baño de aceite y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos antes de transferirlo a un baño de hielo. Una vez que la reacción se enfríe, ajuste el pH a aproximadamente 10 utilizando un hidróxido de sodio molar.
Añadir la mezcla a una columna de centrifugación de 30 kilodalton en lotes de 15 mililitros y centrífuga a 3. 082 veces g durante 15 minutos para purificar la mezcla de reacción. En primer lugar, mezcle las nanopartículas de sulfuro de cobre tapadas con ácido fólico a la concentración adecuada en medios RPMI frescos. Añadir esta solución de nanopartículas a cada pozo de la placa de 24 pozos preparada que contiene células SK-OV-3 a una concentración de 400 microgramos por mililitro.
Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de esto, tripsina las células con 0,5 mililitros de 0,25%trypsin y EDTA. Para neutralizar la tripina, agregue al menos un mililitro de RPMI 1640 sin ácido fólico y centrifugar las células a 123 veces g durante seis minutos.
Para lavar las células, retire el sobrenadante, resuspender las células en dos mililitros de PBS y centrífuga a 123 veces g durante seis minutos. Repita este paso de lavado dos veces para eliminar las nanopartículas no enlazadas. Luego resuspendir las células con uno a dos mililitros de una solución de 2%Tween en PBS.
Cuente las células usando un hemocicómetro y Trypan Blue. Diluir las células en una solución de 2%Tween en PBS a la concentración elegida para la detección. Utilice el archivo STL tridimensional proporcionado para imprimir en 3D el tanque de flujo con termoplástico ABS o plástico PLA.
Después de imprimir el tanque, limpie y ensamble el sistema para su uso. Coloque los cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de un milímetro por tres milímetros y el orificio de un centímetro en el sistema de flujo y selle cuidadosamente con silicona para evitar fugas. A continuación, coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona.
Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del lado del tanque de flujo de tal manera que el tubo capilar de vidrio esté directamente por encima y delante de la ranura de tres milímetros y el orificio de un centímetro. Selle el tubo con silicona. A continuación, conecte el transductor a un pulsador y receptor de ultrasonido.
Amplifique la señal con una ganancia de decibelios 59. Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósitos equipado con una matriz de puertas programables de campo incorporada. Conecte uno de los tubos que vienen de la cámara de flujo a una unión T que está conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.
Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 microlitros por minuto y ajuste la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 microlitros por minuto. A continuación, conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un contenedor de 10% de lejía para eliminar las células después de salir del sistema de flujo.
Coloque la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor en la vista de campo del microscopio para permitir una colocación cuidadosa de la fibra óptica por encima de la muestra de manera que ilumine toda la anchura del tubo. Irradiar la muestra utilizando una fibra óptica canalizando un láser de estado sólido bombeado por diodo que funciona a una longitud de onda de 1.053 nanómetros. Utilice una cámara montada en un microscopio para registrar el flujo, la cocción del láser y el paso de muestras a través del sistema de flujo.
En este estudio, la citometría de flujo fotoacústico y el agente de orientación de sulfuro de cobre dirigido se utilizan para detectar células tumorales circulantes de ovario. Una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas muestra que el tamaño promedio de una nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nanómetros. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se miden perpendiculares entre sí y se promedian aún más.
El diámetro hidrodinámico promedio de estas partículas es de 73,6 nanómetros. Las nanopartículas de sulfuro de cobre tienen una curva de absorbancia característica que se extiende hacia el infrarrojo cercano. Hay un ligero artefacto alrededor de 850 nanómetros que es causado por el cambio de láseres por el espectrofotómetro.
Las imágenes de microscopía de fluorescencia de células incubadas con nanopartículas etiquetadas fluorescentemente muestran que la absorción de nanopartículas se puede visualizar por la presencia de fluorescencia a través de la célula. Las células no incubadas con nanopartículas no muestran señal fluorescente. La presencia de esta señal fluorescente indica la absorción exitosa de las partículas y su capacidad para ser detectadas en el sistema de flujo.
Aquí se muestran ejemplos de señales típicas de adquisición de datos. Los datos sin procesar indican las diferencias de señal entre las células etiquetadas con nanopartículas nanopartículas, PBS y ácido fólico tapados con ácido fólico. Utilizando la vista de laboratorio personalizada y el software MATLAB, las reconstrucciones de imágenes se realizan de los controles positivos y negativos en tiempo real y después de la adquisición, respectivamente.
Los envolventes individuales se convierten posteriormente en valores de píxel y se muestran como columnas independientes. Se producen diferencias claras en la señal fotoacústica entre PBS y las nanopartículas de sulfuro de cobre tapada con ácido fólico a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Durante este procedimiento, es fundamental alinear correctamente el transductor de ultrasonido, el microscopio y la fibra óptica dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.
Confirme la alineación del sistema probando controles positivos y negativos. Debido a la versatilidad de las técnicas de segmentación fotoacústica y a la amplia gama de aplicaciones posibles utilizando PAFC, esta técnica allana el camino para aplicaciones clínicas y de investigación traslacionalmente importantes. Para garantizar la aplicación clínica, se deben centrar más estudios en el análisis de muestras de pacientes y la reducción de los pasos procesales.
La síntesis de las nanopartículas debe tener lugar en una campana de humo químico utilizando el equipo de protección adecuado. Las líneas celulares humanas deben manejarse de acuerdo con las directrices de su institución. El uso del láser requiere entrenamiento de seguridad radiológica y EPP adecuado.
El uso de láser y las pruebas fotoacústicas solo deben ser realizadas por personal altamente capacitado.
