La inmunohistoquímica fluorescente múltiple identifica múltiples tipos de células y sus ubicaciones en tejido integrado de parafina fijada en formalina, lo que permite no sólo la identificación celular, sino también el análisis espacial de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica manual es el uso de múltiples anticuerpos de la misma especie sin reactividad cruzada. Esta técnica permite una visión en profundidad de las interacciones de las células inmunes y cancerosas en el microambiente tumoral.
Al probar esta técnica por primera vez, permita aproximadamente tres a cuatro días de tinción y realice un seguimiento de cada paso completamente durante el proceso. Un método más débil del proceso de tinción y el diseño multiplex es fundamental para disminuir los escollos comunes y esperados. Comience desparafinando y rehidratando las diapositivas.
Colóquelos en el horno de hibridación con el lado del tejido hacia arriba y hornéelos a 60 grados Centígrados durante una hora. Saque las diapositivas del horno y déjelas enfriar durante cinco a 10 minutos en un portaobjetos vertical. A continuación, utilice un conjunto de tinción deslizante para tratar las diapositivas tres veces con xileno y una vez con 100%etanol, 95% etanol y 70% etanol durante 10 minutos cada uno.
Lave el estante de los portaobjetos con agua desionizada y luego fije las diapositivas sumergiéndolas en formalina tamponada neutra durante 30 minutos. Lave los toboganes con agua durante dos minutos y proceda con la recuperación de antígenos. Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena de pH 6.0 o pH 9.0 antigen buffer.
Cubra la caja con una envoltura de plástico y fíjela con una banda de goma. Coloque la caja en un microondas equipado con inversor en el borde de la placa giratoria y caliente los portaobjetos durante 45 segundos a una potencia del 100%, seguido de 15 minutos a una potencia del 20%. Deje que las diapositivas se enfríen durante 15 a 20 minutos después de la microwaving.
Mientras tanto, preparar soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos. Preparar el diluyente de anticuerpos primario disolviendo 0,5 gramos de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 mililitros de TBST o 1X PBS. Diluir cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a una concentración optimizada previamente determinada.
Diluir cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de uno a 100. En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo DAPI agregando tres gotas de DAPI a un mililitro de TBST. Una vez que los portaobjetos se enfríen, retírelos del microondas y quítelos de la envoltura de plástico.
Lávelos con agua desionizada durante dos minutos seguido de un lavado de dos minutos con TBST. Después del lavado, seque el portaobjetos alrededor del tejido con una delicada limpieza de la tarea y trace alrededor del exterior del tejido con una pluma de barrera hidrófoba, teniendo cuidado de no tocar el tejido o dejar que se seque. Coloque cada diapositiva en la cámara del humidificador y agregue aproximadamente cuatro gotas de solución de bloqueo al tejido.
A continuación, incubar los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceder con la aplicación primaria de anticuerpos. Retire la solución de bloqueo de cada diapositiva tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y utilice una delicada toallita de tarea para eliminar la solución restante. Coloque el portaobjetos de nuevo en la cámara humidificada, agregue aproximadamente 200 microlitros del anticuerpo primario de trabajo e incubar durante una hora.
Después de la incubación, lave los portaobjetos tres veces sumergiéndolos en TBST durante dos minutos por lavado. Apague el TBST restante de cada diapositiva y aplique aproximadamente de tres a cuatro gotas de anticuerpo secundario. Incubar los portaobjetos en la cámara humidificada durante 10 minutos.
Lave los portaobjetos de nuevo con TBST y aplique aproximadamente 100 microlitros de la solución de trabajo de fluoróforo. Vuelva a colocar los portaobjetos en la cámara humidificada e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado TBST y luego microonda los portaobjetos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito para eliminar los anticuerpos.
Una cosa importante a recordar durante este proceso de tinción de varios días es detenerse después del paso de microwaving y dejar las diapositivas en el tampón de recuperación de antígenos durante la noche, asegurando la integridad del tejido y las manchas. Retire la última aplicación de anticuerpos con la solución de recuperación de antígenos y lave los portaobjetos con agua desionizada seguida de TBST durante dos minutos por lavado. Repita los pasos de tinción para el resto de los pares de fluroforos de anticuerpos y, a continuación, proceda con la aplicación DAPI.
Aplique aproximadamente 150 microlitros de solución DAPI de trabajo a cada tobogán e incubarlos en la cámara humidificada durante 10 minutos. Después de la incubación, lave los portaobjetos con TBST durante aproximadamente 30 segundos y monte los resbalones de la cubierta. Una vez que el medio de montaje se haya secado, aplique un esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del resbalón de la cubierta para fijarlo.
Para analizar el monoplex, imagine las diapositivas en el microscopio con una exposición de 250 milisegundos utilizando DAPI para enfocar. Evalúe cada diapositiva monoplex observando la intensidad de fluorescencia del marcador teñido y compare esta intensidad con el fondo. Utilice la posición de deslizamiento en el multiplexor final si la intensidad del marcador teñido es al menos cinco veces mayor que el fondo.
Al manchar el multiplex, elija el orden adecuado para cada anticuerpo y asigne cada fluoróforo a un anticuerpo. Proceda con la tinción del multiplex como se describió anteriormente y prepare una diapositiva en blanco que reciba diluyente de anticuerpos, diluyente de fluoróforo y TBST en lugar de anticuerpo primario, fluoróforo o DAPI. Cuando esté listo para crear una imagen del multiplex en el microscopio, establezca la exposición en 250 milisegundos para todos los canales y capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
A continuación, utilice el software de análisis para evaluar cada multiplex por color fluorescente falso y por vista de patología, que confirmará la especificidad de cada marcador. Para asegurar el éxito del ensayo multiplex, se debe realizar un ensayo monoplex para determinar el orden de cada anticuerpo. Por ejemplo, cuando Foxp3 está en la tercera posición de la matriz, se demuestra la tinción y colocación específicas y robustas con CD3.
Por el contrario, cuando Foxp3 está en la primera posición, se produce una tinción inespecífica de Foxp3. Las áreas de color rojo y granulado están presentes en la mayor parte del portaobjetos, y la intensidad fluorescente de estas áreas es baja. Otro paso importante en este ensayo es la contramancha DEPI, que es la base para la identificación celular y el análisis posterior.
Se puede ver un contraste claro entre las imágenes con DAPI que trabajan y no funcionan. Para el ensayo multiplex, las hermosas imágenes compuestas no siempre reflejan una mancha precisa. Mientras que CD3 se visualiza y muestra tinción específica, la vista de campo brillante patológica de CD163 demuestra que el anticuerpo es inespecífico.
Una imagen multiplex óptima muestra una tinción específica en una imagen compuesta, y la especificidad CD3 y CD163 se confirma con la vista de campo brillante de patología. Después de este procedimiento, se pueden realizar cálculos de autoopotipado y análisis espacial para analizar más a fondo las interacciones de celda a célula. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores exploren el patrón espacial de las células y el tejido intacto, mejorando nuestra comprensión del microambiente inmune tumoral.
