Este protocolo es significativo porque permite al usuario generar un sistema de expresión genómica que puede someterse a empalmes alternativos y en este caso formar ARN circulares que se pueden probar para su función y asociación de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que allanará el camino para que otros utilicen este protocolo en biología molecular y clonación al estudiar el empalme alternativo en la formación y función circulares de ARN. Mi consejo a alguien que prueba esta técnica por primera vez sería optimizar las condiciones de PCR.
Ejecute degradados o realice PCR de touchdown con diferentes temperaturas de recocido y tiempos de extensión. Por lo general, los fragmentos más largos de seis KB extenderán un KB por ciclo y diferentes temperaturas de recocido tendrían que ser probados para la mejor amplificación. La demostración de este método es crítica porque dará a los usuarios una mejor representación visual de los aspectos más difíciles del procedimiento especialmente la generación de imprimaciones.
Para comenzar este procedimiento, cargue el Navegador del genoma UCSC y utilícelo para identificar los elementos repetitivos necesarios para la formación circular de ARN e incorporarlos a las construcciones. Es importante destacar que las imprimaciones para amplificación deben estar fuera de los elementos repetitivos. Pegue la secuencia circular de ARN en la búsqueda BLAT humana y seleccione el organismo adecuado.
Envíe la secuencia, vaya a la vista del navegador y a alejar los temporizadores 1.5 o según corresponda. A continuación, pase el ratón sobre los elementos repetitivos para identificar su subtipo en una ventana flotante. Los elementos Alu están en la línea sinusal.
Utilice el botón de pistas predeterminadas debajo de la ventana para restablecer el navegador si se obtiene una imagen incorrecta. Primero ve a ver, ADN en la línea superior del navegador del genoma USCS para descargar la secuencia de ADN que se muestra en la ventana. En la opción de formato de secuenciación, seleccione opciones de mayúsculas y minúsculas/color extendidas.
Seleccione el caso predeterminado como inferior y seleccione el caso de alternancia para NCBI RefSeq. Seleccione subrayado y negrita y cursiva para RepeatMasker. Haga clic en Enviar.
Habrá exones como mayúsculas e intrones como letras minúsculas. Compruebe los bordes de exón/intrón. Si el navegador muestra el complemento inverso, vuelva atrás y seleccione el cuadro de complemento inverso hasta que se muestren los bordes de exón/intrón correctos.
A continuación, copie el archivo con la orientación correcta en un documento de procesamiento de texto y resalte los exones. Seleccione los fragmentos que se van a amplificar asegurándose de que el intrón no comience o termine en una región repetitiva, ya que las imprimaciones en estas regiones no amplificarán secuencias específicas. Para empezar, utilice una herramienta web para diseñar las imprimaciones para la clonación.
Para la secuencia vectorial, agregue el sitio de inserción como el último nucleótido y, posteriormente, agregue los fragmentos. Puesto que la numeración vectorial no comienza con un sitio de inserción determinado, se encuentra el sitio de inserción en el vector y la parte descendente se coloca delante de la secuencia ascendente. Ajuste las imprimaciones si sus puntos de fusión están separados por más de cuatro grados Centígrados y no funcionan en amplificación.
En este estudio, se clonan y analizan los genes de los reporter que generan ARN circulares. Los productos de PCR optimizados se separan en un gel de agarosa del 1% que contiene 1X gel verde. Las bandas individuales representan los productos PCR que se utilizarán en el ensamblaje de ADN enzimático.
Estas bandas se cortan del gel y se purifican. El producto de PCR purificado no funciona fiel al tamaño esperado con gel verde por lo que los productos también se separan en un gel de 1% de agarosa que posteriormente se tiñe con bromuro de etidio para garantizar que los productos tienen el tamaño correcto. Para empezar, establezca un kit de ensamblaje de ADN enzimático.
Combine el vector y las inserciones en una relación molar de uno a dos. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla maestra de ensamblaje de ADN. Incubar muestras durante 60 minutos a 50 grados.
Descongelar las células competentes sobre hielo durante la incubación. Las células deben estar en un volumen de 50 microlitros. A continuación, transforme las celdas competentes con la reacción total del ensamblaje.
Añadir dos microlitros del producto ensamblado refrigerado a las células competentes. Mezcle moviendo suavemente el tubo de cuatro a cinco veces. No vórtice.
Coloque la mezcla sobre hielo durante 30 minutos. Choque térmico de la mezcla a 42 grados Centígrados durante 30 segundos. Luego colóquelo de nuevo sobre hielo durante dos minutos.
Después de esto, agregue 950 microlitros de medios SOC a temperatura ambiente al tubo. Incubar a 37 grados centígrados durante 60 minutos mientras se agita a 300 RPM. Durante esta incubación, calentar dos placas de selección que contengan el antibiótico adecuado.
Después de la incubación, centrifugar el tubo de reacción a 10.000 g durante 30 segundos para peletizar las células y la placa hacia fuera 25% de las células en una placa de selección y 75% en la otra. Incubar estas placas durante la noche a 37 grados centígrados. Antes de comenzar la transfección, revise su ADN por resumen de restricción.
Aquí, un minigeno tau representativo que contiene exones nueve a 12 se corta con enzimas de restricción indicadas para descartar recombinaciones importantes. Para la transfección, disolver primero el clorhidrato lineal de polietileno en agua a una concentración de un miligramo por mililitro a pH dos. Utilice hidróxido de sodio para llevar el pH hasta siete y el filtro estéril de la solución con un filtro de 0,22 micrómetros.
Almacene la solución a cuatro grados centígrados hasta que esté lista para usar. Luego divida las células en los pozos de una placa de seis pozos y déjelas crecer durante la noche en medios DMEM que contengan 10%FBS. Al día siguiente, aliquot un microgramo del gen notificado en un tubo estéril y añadir 200 microlitros de cloruro de sodio estéril filtrado 150 mililitros.
Mezclar por vórtices. A continuación, añadir la solución de polietilenimina a esta mezcla en una proporción de tres microlitros de polietilenimina para cada uno microgramos de ADN. Centrifugar brevemente para recoger muestras en la parte inferior del tubo.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agréguelo directamente a las celdas HEK293. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, utilice un kit de aislamiento de ARN para aislar el ARN para RT-PCR. CDNA de dos muestras derivadas de los tejidos cerebrales humanos se amplifican con imprimaciones circulares de ARN circ tau exon 1210 reverse y circ tau exon 1211 hacia adelante. Mientras que la banda esperada correspondiente al ARN circular tau se ve, las otras bandas fuertes son artefactos que no coincidían con el genoma humano.
Este experimento se repite con condiciones de PCR idénticas, pero la transcripción inversa se realizó sólo con el circ tau exon 1210 in- reverse primer. Sólo la banda esperada se amplifica y valida a través de la secuenciación. A continuación, el ARN se trata con RNase R que elimina el ARN lineal.
El ARN circular es detectable después del tratamiento, mientras que el ARN lineal ya no da una señal detectable. El ARN se aísla las 24 horas después de la transfección y se analiza mediante RT-PCR. La amplificación del ARNm tau lineal muestra dos bandas debido al empalme alternativo del exón 10.
Su relación cambia a la expresión excesiva de factores de empalme. La amplificación del ARN circular 1210 tau muestra la dependencia de la expresión de ARN tau circ en la expresión de algunos factores de empalme, especialmente la quinasa similar a Cdc2 CLK2 y la proteína SR 9G8. Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es el diseño y la ubicación de las imprimaciones al construir un minigene.
La imprimación no debe estar en elementos repetitivos y tendrá que ser optimizada en diferentes condiciones dependiendo del fragmento que se amplifica. Siguiendo este procedimiento, otros métodos que se pueden realizar probarán la función de los ARN circulares. Los usuarios pueden probar la traducción o el secuestro de proteínas para identificar una función para el ARN circular específico que el usuario está interesado en.
Esta técnica allanó el camino para utilizar fragmentos genómicos en un sistema de minigene que puede expresar en exceso los ARN circulares permitiendo al usuario probar e identificar su función y en algunos aspectos su asociación a la enfermedad. La implicación de esta técnica se extiende hacia posibles terapias y diagnósticos de una enfermedad en particular, por ejemplo tauopatías, enfermedades neurodegenerativas asociadas con la patología tau. Hemos descubierto que la proteína tau asociada al microtúbulo, conocida como MAPT, genera ARN circulares que creemos que están contribuyendo a la patología de la enfermedad y este método nos permite estudiar completamente estos ARN circulares e identificar su función y relación con la enfermedad.
Este método podría proporcionar información sobre una mejor comprensión de los ARN circulares, cuáles son sus funciones y el papel que pueden desempeñar en ciertas enfermedades. Este método se puede aplicar en la clonación de otros minigenes que expresan ARN circulares a través de especies donde puede proporcionar información sobre su función. La amplificación de los productos PCR resulta ser la más difícil con fragmentos largos amplificados a partir del ADN genómico, además de tener múltiples elementos repetitivos dentro del fragmento.
