Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer sobre cómo el microambiente apoya el crecimiento tumoral o si un medicamento específico puede inhibir eficazmente la progresión del cáncer de mama. Las principales ventajas de la técnica de inducción tumoral son que no se necesita cirugía y es una forma menos invasiva en la que establecer el cáncer de mama in situ. Usando esta técnica, las células tumorales crecen dentro de la almohadilla de grasa mamaria, en el entorno de tejido adecuado, imitando la progresión del cáncer de mama humano más estrechamente que la inyección subcutánea o el xenoinjerto a las células de los ratones.
Ke-Xin Cao, nuestro técnico, y yo.ayudaremos a Gan-Lin Zhang a demostrar este procedimiento. El día antes de la operación, sujeta manualmente el ratón receptor y gira el lado del vientre del animal hasta el pelaje para afeitarse alrededor de los cuartos pezones. Limpie el pelaje con una fina capa de crema depilatoria.
Use agua destilada para quitar la crema después de 30 a 60 segundos y seque el ratón con toallas de papel suaves. El día de la operación, diluir la suspensión de la célula de cáncer de mama murino a dos veces diez a las quintas células por mililitro de concentración de PBS, en un tubo de microcentrífuga estéril sobre hielo. Antes de cada inyección, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de 45 por 16, con 50 microlitros de células por ratón.
Y confirmar la falta de respuesta a la pellizca del dedo en cada animal sedado. Aplicar un pomada en los ojos del animal y usar pinzas para hacer la carpa de la piel alrededor del cuarto pezón del primer ratón, para crear un túnel para que la jeringa lo siga. Sostenga la jeringa con el bisel mirando hacia arriba y entre por vía subcutánea en la piel a cinco a 10 milímetros del pezón, siguiendo el túnel hasta que la punta de la aguja casi llegue al pezón.
El uso de pinzas para la tienda de campaña de la piel alrededor del primer pezón crea un túnel para la jeringa a seguir. La aguja debe introducirse entre las puntas de la pinza y debe levantarse en lugar de deprimirse en el tejido. Mueva con cuidado la punta de la aguja hacia arriba en la almohadilla de grasa mamaria hasta que el bisel esté debajo del pezón, y suelte la tienda de la piel para permitir una inyección lenta de las células cancerosas.
Tras la inserción, mueva cuidadosamente la punta de la aguja hacia arriba en la almohadilla de grasa mamaria hasta que el bisel esté debajo del pezón. Y sentirá resistencia para asegurar la entrega de las células a la ubicación correcta. Cuando se hayan inyectado todas las células, gire la aguja ligeramente hacia un lado y retraiga la jeringa lentamente.
Use un hisopo de algodón para aplicar presión sobre la herida de la aguja durante 10 a 20 segundos, para hacer que no haya filtración fluida. El pezón inyectado debe aparecer como una esfera transparente, blanca y plana, con el pezón en el centro. Para establecer el volumen tumoral, sujeta el lado del vientre del ratón hacia arriba y usa una pinza para medir la longitud y el ancho del tumor.
Para capturar la bioluminiscencia tumoral, 10 minutos antes de la toma de imágenes inyecta 150 miligramos por kilogramo de D-luciferina en la parte posterior del cuello del ratón. Y capture imágenes de bioluminiscencia del tumor primario y metástasis bajo los parámetros de imágenes de bioluminiscencia apropiados. En el momento de tiempo experimental adecuado, utilice tijeras para extraer el tumor de la piel.
Y aplicar las soluciones analgésicas en el sitio quirúrgico para aliviar el dolor postoperatorio. A continuación, cierre la piel con suturas quirúrgicas de acuerdo con los protocolos estándar. Permita que el animal se recupere bajo una lámpara de calentamiento con monitoreo hasta la recuperación completa.
Usa un bisturí para cortar el tumor primario en dos partes iguales. Almacene la mitad del tejido en 4%paraformaldehído para la posterior tinción de hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica. Congele la otra mitad en nitrógeno líquido para la hinchazón occidental o el aislamiento de ARNi.
En el punto final experimental adecuado cosecha los pulmones de acuerdo con los protocolos de disección estándar y lavar el órgano en PBS. Luego fije los pulmones en 4%paraformaldehído para verificar la metástasis mediante la tinción de hematoxilina y eosina. El crecimiento del tumor primario se puede medir por el volumen tumoral y la bioluminiscencia de células tumorales vivas, como se ha demostrado.
Las metástasis no se observan durante las primeras etapas de la inoculación, ya que no se ha establecido ningún tumor secundario, o las señales bioluminiscentes fuertes del tumor primario obstruyen la detección de pequeños focos metastásicos con señales débiles. Después de la resección, se puede detectar y analizar la señal de bioluminiscencia de los focos metastásicos de órganos distantes. El análisis de la morfología tanto del tumor primario de mama como de las secciones pulmonares mediante la hematoxilina y la tinción de eosina revela un aumento de la angiogénesis en los animales inoculados de la célula tumoral, como lo demuestra la tinción anti-CD31 de marcadores de microvajillones.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la punta de la aguja está en la ubicación correcta antes de administrar las células tumorales. Después de este procedimiento, los atomizadores, como el ultrasonido animal, se pueden realizar para responder preguntas adicionales sobre la suplementación de la vejiga del tumor primario in vivo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la tumorigenesis y el desarrollo de fármacos en la exploración de los factores clave y vías implicadas en la tumorigenesis y los mecanismos de fármacos contra el cáncer en modelos animales murinos.
No olvide que trabajar con isoflurano u otra anestesia de gas puede ser extremadamente difícil de dosificar y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de una máscara de carbón activada durante la realización de este procedimiento.
