이 방법은 마이크로 환경이 종양 성장을 지원하는 방법 또는 특정 약물이 유방암 진행을 효과적으로 억제 할 수 있는지 여부에 대한 암 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종양 유도 기술의 주요 장점은 수술이 필요하지 않으며 그 안에 유방암을 확립하는 덜 침습적 인 방식이라는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 종양 세포는 마우스 세포에 피하 주사 또는 xenograft 보다는 인간 유방암 진행을 더 밀접하게 모방하는 적당한 조직 환경에서, 유방 지방 패드 내, 마우스 세포에 피하 주사 또는 xenograft보다는 더 밀접하게 성장합니다.
케신 카오, 우리의 기술자, 그리고 나는, 이 절차를 시연에 간 린 장 도움이 될 것입니다. 수술 전날, 수취인 마우스를 수동으로 제지하고 동물 배면을 털로 돌려 네 번째 젖꼭지 주위에 면도합니다. 탈모 크림의 얇은 층으로 모피를 닦아.
증류수를 사용하여 30~60초 후에 크림을 제거하고 부드러운 종이 타월로 마우스를 건조시다. 수술 당일, 뮤린 유방암 세포 현탁액을 PBS 농도의 밀리리터 당 5분의 1에 2배, 얼음상에 멸균 된 미세원심분리기 튜브로 희석한다. 각 주입 전에, 마우스 당 세포의 50 마이크로 리터와 함께 45 x 16 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를 로드합니다.
그리고 각 진정 된 동물에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 동물의 눈에 연고를 바르고 핀셋을 사용하여 첫 번째 마우스의 네 번째 젖꼭지 주위에 피부를 텐트로 사용하여 주사기를 위한 터널을 만듭니다. 주사기를 위쪽으로 향하는 주사기를 잡고 바늘 끝이 젖꼭지에 거의 도달할 때까지 터널을 따라 젖꼭지에서 5~10mm의 피부에 피하로 들어가게 됩니다.
핀셋을 사용하여 첫 번째 젖꼭지 주위의 피부를 텐트로 사용하면 주사기가 따라갈 수있는 터널이 만들어집니다. 바늘은 트위저 팁 사이에 입력해야하며 조직에 우울대신 제기해야합니다. 조심스럽게 벨이 젖꼭지 아래에있을 때까지 유방 지방 패드로 바늘 팁을 이동하고 암세포의 느린 주입을 허용하기 위해 피부 텐트를 해제합니다.
삽입 시 바늘 끝을 유방 지방 패드로 조심스럽게 움직인다. 그리고 당신은 올바른 위치에 세포의 전달을 보장하기 위해 저항을 느낄 것이다. 모든 세포가 주입되면 바늘을 옆으로 살짝 돌리고 주사기를 천천히 철회하십시오.
면 봉면을 사용하여 바늘 상처에 압력을 10~20초 동안 가가하여 유체 가시가 없는지 확인합니다. 주입된 젖꼭지는 중앙에 젖꼭지가 있는 투명하고 흰색, 평평한 구로 나타나야 합니다. 종양 부피를 확립하기 위해 마우스 배면을 위로 억제하고 캘리퍼를 사용하여 종양 길이와 폭을 측정합니다.
종양 생물 발광을 포착하기 위하여는, 화상 진찰 의 앞에 10 분 마우스의 목의 뒤쪽에 D-luciferin의 킬로그램 당 150 밀리그램을 주입합니다. 그리고 적절한 생물 발광 이미징 매개 변수하에서 1 차 종양 및 전이의 생물 발광 이미지를 캡처합니다. 적절한 실험 시점에서 가위를 사용하여 피부에서 종양을 수확하십시오.
그리고 수술 후 통증을 완화하기 위해 수술 부위에 진통 솔루션을 적용하십시오. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 외과 봉합사로 피부를 닫습니다. 동물이 완전한 회복될 때까지 모니터링하여 온난화 램프 아래에서 회복하도록 허용합니다.
메스를 사용하여 1차 종양을 두 개의 동일한 조각으로 자른다. 후속 헤마톡시린과 에신 염색 및 면역 조직 화학을 위해 조직의 절반을 4% 파라포름데히드에 저장합니다. 서쪽 블로팅 또는 RNAi 절연을 위한 액체 질소에 있는 나머지 반을 동결합니다.
적절한 실험 종점에서 표준 해부 프로토콜에 따라 폐를 수확하고 PBS에서 장기를 세척합니다. 그런 다음 폐를 4% 파라포름알데히드로 고정하여 헤마톡클린과 에오신 염색에 의한 전이를 확인합니다. 1 차적인 종양 성장은 입증된 바와 같이 종양 부피 및 살아있는 종양 세포 생물 발광에 의해 측정될 수 있습니다.
전이는 접종의 초기 단계에서 이차 종양이 확립되지 않았거나, 1차 종양의 강력한 생체 발광 신호가 약한 신호로 작은 전이성 초점의 검출을 방해하기 때문에 관찰되지 않는다. 절제 후, 먼 장기의 전이성 초점으로부터의 생체 발광 신호를 검출하고 분석할 수 있다. 헤마톡시린과 에오신 염색에 의한 1차 유방종양 및 폐 단면의 형태학을 분석한 결과, 항 CD31 마이크로용기 마커 염색에 의해 입증된 바와 같이 종양 세포 접종 동물의 혈관신생이 증가하는 것으로 나타났습니다.
이 절차를 시도할 때, 바늘 끝이 종양 세포를 전달하기 전에 정확한 위치에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 동물 초음파 와 같은 분무기는 생체 내 1 차 종양의 방광 보충에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 종양 발생 및 종양 발생에 관련 된 주요 요인 및 경로 와 뮤린 동물 모델에서 항 암 약물의 메커니즘을 탐구에 있는 약물 개발의 분야에서 연구원을 위한 길을 열었습니다.
이소플루란 이나 다른 가스 마취와 함께 작업 하는 것은 복용량을 매우 어려울 수 있습니다 그리고 활성화 된 탄 마스크를 사용 하 여 같은 예방 조치를 취 해야 하는 것을 잊지 마세요, 항상이 절차를 수행 하는 동안 취해야 한다.
