Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do câncer sobre como o microambiente apoia o crescimento do tumor ou se uma droga específica pode efetivamente inibir a progressão do câncer de mama. As principais vantagens da técnica de indução do tumor são que não é necessária cirurgia e é uma forma menos invasiva para estabelecer o câncer de mama in situ. Usando essa técnica, as células tumorais crescem dentro da almofada de gordura mamária, no ambiente de tecido apropriado, imitando a progressão do câncer de mama humano mais de perto do que a injeção subcutânea ou xenoenxerto para células de camundongos.
Ke-Xin Cao, nosso técnico, e eu, ajudaremos Gan-Lin Zhang a demonstrar este procedimento. No dia anterior à operação, contenha manualmente o rato receptor e vire o lado da barriga do animal até a pele para ser raspado ao redor dos quartos mamilos. Limpe a pele com uma fina camada de creme depilatório.
Use água destilada para remover o creme após 30 a 60 segundos e seque o mouse com toalhas de papel macio. No dia da operação, diluir a suspensão da célula de câncer de mama murina para duas vezes dez a cinco células por mililitro de concentração de PBS, em um tubo de microcentrifuge estéril no gelo. Antes de cada injeção, carregue uma, uma seringa mililitro equipada com uma agulha de 45 por 16, com 50 microliters de células por rato.
E confirmar a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em cada animal sedado. Aplique pomada nos olhos do animal e use pinças para enrolar a pele ao redor do quarto mamilo do primeiro rato, para criar um túnel para a seringa seguir. Segure a seringa com o bisel voltado para cima e subcutâneo entre na pele a cinco a 10 milímetros do mamilo, seguindo o túnel até que a ponta da agulha quase atinja o mamilo.
Usar pinças para enrolar a pele ao redor do primeiro mamilo cria um túnel para a seringa seguir. A agulha deve ser inserida entre as pontas da pinça e deve levantar-se em vez de deprimente no tecido. Mova cuidadosamente a ponta da agulha para dentro da almofada de gordura mamária até que o bisel esteja sob o mamilo, e solte a tenda da pele para permitir uma injeção lenta das células cancerosas.
Após a inserção, mova cuidadosamente a ponta da agulha para cima na almofada de gordura mamária até que o bisel esteja sob o mamilo. E você sentirá resistência para garantir a entrega das células ao local correto. Quando todas as células tiverem sido injetadas, gire a agulha ligeiramente para o lado e retraia a seringa lentamente.
Use um cotonete para aplicar pressão na ferida da agulha por 10 a 20 segundos, para fazer com que não haja infiltração de fluido. O mamilo injetado deve aparecer como uma esfera transparente, branca e plana, com o mamilo no centro. Para estabelecer o volume do tumor, contenha o lado da barriga do rato para cima e use uma pinça para medir o comprimento e largura do tumor.
Para capturar a bioluminescência tumoral, 10 minutos antes de a imagem injetar 150 miligramas por quilograma de D-luciferina na parte de trás do pescoço do camundongo. E capturar imagens de bioluminescência do tumor primário e metástases sob os parâmetros apropriados de bioluminescência de imagem. No momento experimental apropriado, use uma tesoura para colher o tumor da pele.
E aplique as soluções analgésicas no local cirúrgico para aliviar a dor pós-operatória. Em seguida, feche a pele com suturas cirúrgicas de acordo com os protocolos padrão. Permita que o animal se recupere sob uma lâmpada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa.
Use um bisturi para cortar o tumor primário em dois pedaços iguais. Armazene metade do tecido em 4% de paraformaldeído para posterior coloração de hematoxilina e eosina e imunohistoquímica. Congele a outra metade em nitrogênio líquido para manchas ocidentais ou isolamento RNAi.
No ponto final experimental apropriado colher os pulmões de acordo com protocolos de dissecção padrão e lavar o órgão em PBS. Em seguida, fixar os pulmões em 4% de paraformaldeído para verificar a metástase por hemaoxilina e eosina. O crescimento do tumor primário pode ser medido pelo volume do tumor e bioluminescência das células tumorais vivas, como demonstrado.
Metástases não são observadas durante os estágios iniciais da inoculação, pois nenhum tumor secundário foi estabelecido, ou os fortes sinais bioluminescentes do tumor primário obstruem a detecção de pequenos focos metastáticos com sinais fracos. Após a ressecção, o sinal de bioluminescência dos focos metastáticos de órgãos distantes pode ser detectado e analisado. A análise da morfologia tanto do tumor primário da mama quanto das seções pulmonares por hematoxilina e eosina revela o aumento da angiogênese nos animais inoculados da célula tumoral, como evidenciado pela coloração do marcador de microvaso anti-CD31.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para ter certeza de que a ponta da agulha está no local correto antes de entregar as células tumorais. Após esse procedimento, atomizadores, como o ultrassom animal, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a suplementação da bexiga do tumor primário in vivo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da tumorgênese e do desenvolvimento de medicamentos na exploração dos principais fatores e caminhos envolvidos na tumorigênese e os mecanismos da droga anticâncnea em modelos animais murinos.
Não se esqueça que trabalhar com isoflurane ou outra anestesia de gás pode ser extremamente difícil de dosar e que precauções como o uso de uma máscara de carbono ativada, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
