Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro su come il microambiente supporta la crescita del tumore o se un farmaco specifico può inibire efficacemente la progressione del cancro al seno. I principali vantaggi della tecnica di induzione tumorale sono che non è necessario alcun intervento chirurgico ed è un modo meno invasivo in cui stabilire il cancro al seno in situ. Usando questa tecnica, le cellule tumorali crescono all'interno del cuscinetto grasso mammario, nell'ambiente tissutale appropriato, imitando la progressione del cancro al seno umano più da vicino rispetto all'iniezione sottocutanea o allo xenografto alle cellule dei topi.
Ke-Xin Cao, il nostro tecnico ed io, aiuteremo Gan-Lin Zhang a dimostrare questa procedura. Il giorno prima dell'operazione, trattenere manualmente il mouse ricevente e ruotare il lato della pancia animale verso la pelliccia per essere rasato intorno ai quattro capezzoli. Pulire la pelliccia con un sottile strato di crema depilatoria.
Utilizzare acqua distillata per rimuovere la crema dopo 30-60 secondi e asciugare il mouse con morbidi asciugamani di carta. Il giorno dell'operazione, diluire la sospensione delle cellule tumorali del seno murino a due volte dieci alla quinta cella per millilitro di concentrazione di PBS, in un tubo di microcentrifugo sterile sul ghiaccio. Prima di ogni iniezione, caricare una siringa millilitro dotata di un ago 45 per 16, con 50 microlitri di cellule per topo.
E confermare una mancanza di risposta al dito del dito in ogni animale sedato. Applicare unguento agli occhi dell'animale e utilizzare una pinzetta per tendere la pelle intorno al quarto capezzolo del primo topo, per creare un tunnel da seguire per la siringa. Tenere la siringa con la smussatura rivolta verso l'alto ed entrare per via sottocutanea nella pelle a cinque-10 millimetri dal capezzolo, seguendo il tunnel fino a quando la punta dell'ago raggiunge quasi il capezzolo.
L'uso di pinzette per tendare la pelle intorno al primo capezzolo crea un tunnel da seguire per la siringa. L'ago deve essere inserito tra le punte della pinzetta e dovrebbe sollevarsi invece di deprimere nel tessuto. Spostare con cura la punta dell'ago nel cuscinetto grasso mammario fino a quando la smussatura è sotto il capezzolo e rilasciare la tenda della pelle per consentire una lenta iniezione delle cellule tumorali.
Al momento dell'inserimento, spostare attentamente la punta dell'ago nel cuscinetto grasso mammario fino a quando la smussatura è sotto il capezzolo. E sentirai resistenza per garantire la consegna delle cellule nella posizione corretta. Quando tutte le cellule sono state iniettate, ruotare leggermente l'ago di lato e ritrarre lentamente la siringa.
Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare pressione sulla ferita dell'ago per 10-20 secondi, per evitare infiltrazioni di liquidi. Il capezzolo iniettato dovrebbe apparire come una sfera trasparente, bianca e piatta, con il capezzolo al centro. Per stabilire il volume tumorale, trattenere il lato della pancia del topo verso l'alto e utilizzare una pinza per misurare la lunghezza e la larghezza del tumore.
Per catturare la bioluminescenza tumorale, 10 minuti prima dell'imaging iniettare 150 milligrammi per chilogrammo di D-luciferina nella parte posteriore del collo del topo. E catturare immagini di bioluminescenza del tumore primario e delle metastasi sotto gli appropriati parametri di imaging della bioluminescenza. Nel momento sperimentale appropriato, utilizzare le forbici per raccogliere il tumore dalla pelle.
E applicare le soluzioni analgesiche al sito chirurgico per alleviare il dolore post-operatorio. Quindi chiudere la pelle con suture chirurgiche secondo protocolli standard. Consentire all'animale di riprendersi sotto una lampada riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero.
Usa un bisturi per tagliare il tumore primario in due pezzi uguali. Conservare la metà del tessuto in paraformaldeide al 4% per la successiva colorazione ematossilina ed eosina e immunoistochimica. Congelare l'altra metà in azoto liquido per l'isolamento occidentale o RNAi.
All'endpoint sperimentale appropriato raccogliere i polmoni secondo protocolli di dissezione standard e lavare l'organo in PBS. Quindi fissare i polmoni in paraformaldeide al 4% per verificare la metastasi mediante colorazione di ematossilina ed eosina. La crescita primaria del tumore può essere misurata dal volume tumorale e dalla bioluminescenza delle cellule tumorali viventi, come dimostrato.
Le metastasi non si osservano durante le prime fasi dell'inoculazione in quanto non è stato stabilito alcun tumore secondario o i forti segnali bioluminescenti del tumore primario ostruiscono il rilevamento di piccoli focolai metastatici con segnali deboli. Dopo la resezione, il segnale di bioluminescenza proveniente dai focolai metastatici di organi distanti può essere rilevato e analizzato. L'analisi della morfologia sia del tumore al seno primario che delle sezioni polmonari mediante colorazione ematossilina ed eosina rivela un aumento dell'angiogenesi negli animali inoculati delle cellule tumorali come evidenziato dalla colorazione marcatore di microvessel anti-CD31.
Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che la punta dell'ago si trova nella posizione corretta prima di fornire le cellule tumorali. Seguendo questa procedura, gli atomizzatori, come gli ultrasuoni animali, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sull'integrazione della vescica del tumore primario in vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tumorigenesi e dello sviluppo del farmaco nell'esplorazione dei fattori chiave e dei percorsi coinvolti nella tumorigenesi e nei meccanismi del farmaco anti-cancro nei modelli animali murini.
Non dimenticare che lavorare con isoflurane o altra anestesia gassoso può essere estremamente difficile da dosare e che precauzioni come l'uso di una maschera di carbone attivo, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
