Questo è il primo articolo che affronta problemi tecnici nel sequenziamento di piccoli RNA derivati da vescicole extracellulari dalle cellule. I campioni NGS richiedono una preparazione rigorosa e un controllo di qualità. A causa della natura dei veicoli elettrici, il processo qc dei campioni di veicoli elettrici si discosta dalla norma.
Il vantaggio di questo protocollo sono i passaggi qc in esso per gli utenti per la prima volta. A dimostrare la procedura sarà Junyi Su, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Per cominciare, placcare le cellule staminali mesenchimali umane a 2.000 cellule per centimetro quadrato in supporti MSC freschi in cinque contenitori T175.
Quindi far crescere le cellule a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% e sostituire il supporto ogni due o tre giorni, fino a ottenere cinque fiasche di cellule confluenti al 90%. Quindi, lavare le cellule tre volte con 20 millilitri di PBS per pallone. Aggiungere 20 millilitri di supporti di raccolta EV in ogni pallone.
E incubarli a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per 48 ore. Raccogliere il supporto e centrifugarlo per 10 minuti a 300 g e quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il supernatante e centrifugare il supporto per 20 minuti a 2.000 g e quattro gradi Celsius.
Raccogli di nuovo il supernatante e centrifuga il supporto per 30 minuti a 15, 500 g e quattro gradi Celsius. Raccogli il supernatante per l'ultima volta. Successivamente, trasferire il supporto su tubi ultracentrifugo.
Qui viene utilizzato un rotore ad angolo fisso da 60Ti e il pellet verrà ancorato al lato del tubo. Contrassegnare il lato del coperchio in cui è previsto il pellet e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet. E pellettare gli exRNA per 90 minuti a 100.000 g e quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione finale, rimuovere il supernatante. Utilizzare piccoli pezzi di carta assorbente per asciugare l'interno del tubo senza toccare il fondo del tubo. E poi invertire il tubo su una carta assorbente.
Per rimospendare il pellet, aggiungere 200 microlitri di PBS in ogni tubo e vortice il tubo per 30 secondi. Pipetta su e giù 20 volte. Quindi valutare le vescicole extracellulari e altre biomolecole con analisi di tracciamento delle nanoparticelle.
E conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori esperimenti. Dopo aver scongelato i campioni, utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore. Elute l'RNA dalla colonna fornita nel kit di isolamento dell'RNA in 100 microlitri di acqua priva di RNAse.
Per concentrare l'RNA attraverso la precipitazione dell'etanolo, aggiungere un microlitro di glicogeno, 10 microlitri di acetato di sodio a due molari pH-5,5 e 250 microlitri di etanolo prerimente refrigerato al 99% in 100 microlitri dell'RNA purificato. Quindi incubare i campioni a meno 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare l'RNA. Per pellettare l'RNA, centrifugare per 20 minuti a 16.000 g e quattro gradi Celsius.
Quindi, rimuovere il supernatante e lavare il pellet di RNA con un millilitro di 75% di etanolo. Centrifugare di nuovo per cinque minuti a 16.000 g e quattro gradi Celsius per pellettare l'RNA. Rimuovere l'etanolo e lasciare aperto il coperchio del tubo dell'RNA per cinque-10 minuti per asciugare all'aria il pellet di RNA.
Rimescolare il pellet di RNA in sette microlitri di acqua priva di RNAse e utilizzare una macchina per l'elettroforesi capillare a base di chip per rilevare la qualità e la concentrazione dell'RNA. Per iniziare la costruzione della libreria, pipettare cinque microlitri dell'RNA in un tubo PCR pre-refrigerato da 0,2 millilitri. Successivamente, diluire gli adattatori da 3' in acqua priva di RNAse con un rapporto volume uno-a-10.
Aggiungere 0,5 microlitri dell'adattatore diluito nel tubo dell'RNA e pipettare la miscela su e giù otto volte. Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Incubare la miscela di adattatori RNA a 70 gradi Celsius per due minuti in un ciclore termico preriscaldato.
E poi riposizionare il campione sul blocco refrigerato. Successivamente, aggiungere un microlitro del buffer di legatura, 0,5 microlitri dell'inibitore della RNAse e 0,5 microlitri della ligasi dell'RNA T4 nella miscela dell'adattatore di RNA. Pipetta su e giù otto volte, e centrifugare brevemente.
Quindi incubare il tubo a 28 gradi Celsius per un'ora nel ciclore termico preriscaldato. Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri della soluzione di arresto nel tubo campione, con il tubo che rimane nel ciclore termico. Pipettare su e giù otto volte e continuare a incubare a 28 gradi Celsius per 15 minuti.
Diluire gli adattatori da 5'in acqua priva di RNA con un rapporto volume uno-a-10. Aggiungere 0,5 microlitri dell'adattatore diluito in un tubo PCR separato da 0,2 millilitri. Riscaldare l'adattatore 5 a 70 gradi Celsius per due minuti.
E poi posizionare il campione sul blocco refrigerato. Aggiungere 0,5 microlitri di ATP da 10 nanomol e 0,5 microlitri della ligasi dell'RNA T4 al tubo adattatore da 5'. Pipetta su e giù otto volte.
E centrifugare brevemente per raccogliere tutti i liquidi nel fondo. Quindi, aggiungere 1,5 microlitri della miscela di adattatori da 5' nel campione di RNA. Pipettare otto volte molto delicatamente e incubare il campione a 28 gradi Celsius per un'ora.
Per ottenere cDNA, diluire il primer inverso della transcriptasi in acqua priva di RNAse con un rapporto di volume uno-a-10. Aggiungere 0,5 microlitri del primer diluito nel campione di RNA, pipettare otto volte molto delicatamente e centrifugare brevemente. Quindi incubare l'RNA e la miscela di primer a 70 gradi Celsius per due minuti nel ciclore termico preriscaldato.
E poi posizionare il campione su un blocco refrigerato. Successivamente, aggiungere un microlitro di 5X First Strand Buffer, 0,5 microlitri di miscela DNTP da 12,5 millimolare, 0,5 microlitri di DTT da 100 millimolare, 0,5 microlitri di inibitore della RNAse e 0,5 microlitri di trascrittasi inversa nel tubo del campione. Pipetta otto volte molto delicatamente.
E centrifugare brevemente. Incubare il campione a 50 gradi Celsius per un'ora nel ciclore termico preriscaldato. Successivamente, aggiungere 4,25 microlitri di acqua ultrapura, 12,5 microlitri del mix PCR, un microlitro del primer indice e un microlitro del primer universale nel campione cDNA.
Pipetta su e giù otto volte, e centrifugare brevemente. Infine, posizionare il campione in un ciclore termico e impostare il ciclore in base al manoscritto. Per purificare la libreria di RNA, utilizzare un frazionatore automatizzato delle dimensioni del DNA per elutare le bande tra 140 e 160 coppie di basi.
Esegui la libreria estratta su un kit di purificazione PCR basato su colonne ed eludi la libreria in 10 microlitri di acqua priva di RNAse. Per controllare le dimensioni della libreria, caricare un microlitro della libreria purificata su un chip DNA e seguire il protocollo del produttore. Per quantificare la concentrazione della libreria, diluire prima un microlitro della libreria purificata in pH-8.0 Tris-Hcl da 10 millimolare con 0,05% di polisorbato 20 con un rapporto volume uno-a-1.000.
Quindi eseguire QPCR utilizzando gli standard dna del kit di quantificazione della biblioteca commerciale. Infine, raggruppare quantità uguali delle librerie in base ai requisiti della macchina di sequenziamento e sequenza su un sistema di sequenziamento ad alta velocità effettiva. L'elettroferogramma degli RNA extracellulari includeva una vasta gamma di RNA.
Al contrario, l'RNA cellulare ha mostrato picchi molto distinti, corrispondenti a 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA e 28SrRNA. La qualità risultante di entrambe le biblioteche era elevata e comparabile. La distribuzione della lunghezza di entrambe le librerie ha mostrato un singolo picco a 22 nucleotidi, correlato con i microRNA.
Al contrario, le librerie degli RNA extracellulari erano più eterogenee, e contenevano altri due picchi correlati con tRNA, metà e frammenti, o piRNA. Il 65% delle letture dall'RNA cellulare sono state mappate ai microRNA umani e ciascuna delle altre piccole RNA rappresentava una piccola parte delle letture mappate. Al contrario, solo l'8% degli RNA extracellulari corrispondeva ai microRNA umani.
Il piccolo RNA più abbondante a cui sono state mappate le letture erano tRNA, e le letture ineguagliate in seguito corrispondevano a sequenze batteriche. Un confronto con il genoma bovino ha suggerito che fbs non era una fonte di contaminazione. Quindi, gli RNA extracellulari mostrano un profilo atipico rispetto al normale RNA cellulare.
La preparazione della biblioteca è una parte cruciale di questo protocollo. La miscelazione deve essere eseguita molto delicatamente per evitare la formazione di bolle. Questo metodo può anche essere utilizzato per indagare il profilo degli exRNA di altri tipi di cellule, il che aiuta a studiare la funzione degli exRNA.
