これは、細胞から細胞外小胞に由来する小さなRNAの配列決定における技術的な問題に対処する最初の論文です。NGS サンプルには、厳格な準備と品質管理が必要です。EVの性質上、EVサンプルのQCプロセスは標準から逸脱しています。
このプロトコルの利点は、初めてのユーザのためのQCステップです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究助手であるJunyi Suです。まず、5つのT175フラスコに新鮮なMSC培地で2,000細胞/平方センチメートルのヒト間葉系幹細胞をプレートします。
その後、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で細胞を増殖させ、90%コンフルエント細胞の5フラスコが得られるまで、2〜3日ごとに培地を交換する。次に、フラスコあたり20ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。各フラスコに20ミリリットルのEV回収培地を加えます。
そして、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で48時間インキュベートします。メディアを収集し、300グラムと摂氏4度で10分間遠心分離機。その後、上清を収集し、2,000グラムと摂氏4度で20分間遠心分離機。
再び上澄み物を収集し、15、500グラムと摂氏4度で30分間メディアを遠心分離します。最後の時間の上清を収集します。次に、超遠心チューブにメディアを移します。
ここでは60Ti固定角度ローターを使用し、ペレットはチューブの側面に固定されます。ペレットが予想される蓋の側面をマークし、ペレットが予想されるチューブの側面に円を描きます。そして、100、000グラムおよび摂氏4度で90分間exRNAをペレットする。
最終的な遠心分離の後、上清を取り除く。チューブの底部に触れることなくチューブの内側を乾燥させるために吸収性の紙の小片を使用してください。そして、吸収性紙の上にチューブを反転します。
ペレットを再懸濁するには、各チューブに200マイクロリットルのPBSを加え、チューブを30秒間渦出させます。ピペットは20回上下します。次に、ナノ粒子追跡解析で細胞外小胞やその他の生体分子を評価します。
そして、さらなる実験までマイナス80度でペレットを保管してください。サンプルを解凍した後、RNA分離キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってRNAを抽出します。RNA分離キットに用意されているカラムからRNAを100マイクロリットルのRNAAseフリー水で溶出させます。
エタノール沈殿を通してRNAを濃縮するには、グリコーゲン1マイクロリットル、2モルpH-5.5酢酸ナトリウム10マイクロリットル、および250マイクロリットルの予冷99%エタノールを精製RNAの100マイクロリットルに加えます。その後、RNAを沈殿させるために一晩マイナス20度でサンプルをインキュベートします。RNAをペレット化するには、16,000gおよび摂氏4度で20分間遠心分離機を用いた。
次に上清を取り除き、75%エタノールの1ミリリットルでRNAペレットを洗浄する。再び16,000gと4°Cで5分間遠心分離機を使用してRNAをペレット化する。エタノールを取り出し、RNAチューブの蓋を5~10分間開いたままにして、RNAペレットを空気乾燥させます。
RNAペレットを7マイクロリットルのRNAAseフリー水で再懸濁し、チップベースのキャピラリー電気泳動機を使用してRNAの品質と濃度を検出します。ライブラリーの構築を開始するために、5マイクロリットルのRNAを、あらかじめ冷蔵した0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。次に、RNAseフリー水の3'アダプターを1対10の体積比で希釈します。
希釈したアダプターの0.5マイクロリットルをRNAチューブに加え、混合物を上下に8回ピペットします。チューブの底にあるすべての液体を収集するために簡単に遠心分離機。RNAアダプター混合物を摂氏70度で2分間、予熱熱サイクラーでインキュベートします。
そして、冷やしたブロックにサンプルを戻します。次に、ライゲーションバッファーの 1 マイクロリットル、RNAse 阻害剤の 0.5 マイクロリットル、および 0.5 マイクロリットルの T4 RNA リガーゼを RNA アダプター混合物に加えます。ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。
その後、予熱サーマルサイクラーで1時間摂氏28度でチューブをインキュベートします。次に、0.5マイクロリットルのストップ溶液をサンプルチューブに加え、チューブをサーマルサイクラーに留めます。ピペットは8回上下し、摂氏28度で15分間インキュベートを続けます。
RNAseフリーウォーターに5'アダプターを1対10の体積比で希釈します。希釈したアダプターの 0.5 マイクロリットルを別の 0.2 ミリリットル PCR チューブに加えます。5'アダプターを摂氏70度で2分間加熱します。
そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。10ナノモルATPの0.5マイクロリットルとT4 RNAリガーゼの0.5マイクロリットルを5'アダプターチューブに加えます。ピペットは8回上下します。
そして、遠心分離機は底にすべての液体を収集するために簡単に。次に、5'アダプター混合物の1.5マイクロリットルをRNAサンプルに加えます。ピペットは非常に穏やかに8回、そして1時間摂氏28度でサンプルをインキュベートします。
cDNAを得るために、RNAAseフリー水中の逆転写酵素プライマーを1対10の体積比で希釈します。希釈したプライマーを0.5マイクロリットルをRNAサンプルに加え、ピペットを8回非常に穏やかに加え、遠心分離機を短時間加えます。その後、RNAとプライマー混合物を摂氏70度で2分間煮込んだ。
そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。次に、5Xファーストストランドバッファーの1マイクロリットル、0.5マイクロリットルの12.5ミリモルDNTP混合物、0.5マイクロリットルの100ミリモルDTT、0.5マイクロリットルのRNAAse阻害剤、および0.5マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルチューブに加えます。ピペット8回非常に穏やか。
そして、遠心分離機は簡単に。予熱サーマルサイクラーで1時間、摂氏50度でサンプルをインキュベートします。次に、4.25マイクロリットルの超純水、12.5マイクロリットルのPCRミックス、インデックスプライマーの1マイクロリットル、ユニバーサルプライマーの1マイクロリットルをcDNAサンプルに加えます。
ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。最後に、サンプルをサーマルサイクラーに入れ、原稿に従ってサイクラーをセットアップします。RNAライブラリを精製するには、自動DNAサイズの分量化器を使用して、140から160の塩基対の間のバンドを溶出させます。
抽出したライブラリーをカラムベースのPCR精製キットで実行し、10マイクロリットルのRNAAseフリー水でライブラリを溶出します。ライブラリのサイズを確認するには、精製されたライブラリの1マイクロリットルをDNAチップにロードし、メーカーのプロトコルに従ってください。ライブラリ濃度を定量化するには、まず1対1、000体積比で0.05%ポリソルベート20で10ミリモルpH-8.0 Tris-Hclで精製されたライブラリの1マイクロリットルを希釈します。
次に、市販ライブラリ定量キットのDNA規格を使用してQPCRを実行します。最後に、シーケンスマシンの要件に応じてライブラリの量を均等にプールし、ハイスループットシーケンシングシステムでシーケンスを行います。細胞外RNAの電解液は広範囲のRNAを含んでいた。
対照的に、細胞RNAは、5StRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、および28SrRNAに対応する非常に明確なピークを示した。両方のライブラリの結果の品質は高く、同等でした。両方のライブラリーの長さの分布は、マイクロRNAと相関する22ヌクレオチドで単一のピークを示した。
対照的に、細胞外RNAのライブラリーはより異種であり、tRNA、半分および断片、またはpiRNAと相関する2つのピークを含んでいた。細胞RNAからの読み取りの65%はヒトマイクロRNAにマッピングされ、他の小さなRNAのそれぞれがマッピングされた読み取りのごく一部を占めた。対照的に、細胞外RNAのわずか8%がヒトマイクロRNAと一致した。
読み取りがマッピングされた最も豊富な小さなRNAはtRNAであり、比類のない読み取りは後に細菌配列に一致した。ウシのゲノムとの比較は、FBSが汚染源ではないことを示唆した。したがって、細胞外RNAは、通常の細胞RNAと比較して非定型プロファイルを示す。
ライブラリの準備は、このプロトコルの重要な部分です。混合は、泡が形成されるのを避けるために非常に穏やかに行われなければなりません。この方法は、他の種類の細胞からのexRNAのプロファイルを調べるのにも使用でき、exRNAの機能を研究するのに役立ちます。
