Este é o primeiro artigo que aborda problemas técnicos no sequenciamento de pequenas RNAs derivadas de vesículas extracelulares de células. As amostras de NGS requerem preparação rigorosa e controle de qualidade. Devido à natureza dos EVs, o processo QC das amostras de EV desvia-se da norma.
A vantagem deste protocolo é que o QC passos para usuários iniciantes. Demonstrando o procedimento estará Junyi Su, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para começar, as células-tronco mesenquimais humanas a 2.000 células por centímetro quadrado em mídia MSC fresca em cinco frascos T175.
Em seguida, cresça as células a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% e substitua a mídia a cada dois ou três dias, até que cinco frascos de células 90% confluentes sejam obtidos. Em seguida, lave as células três vezes com 20 mililitros de PBS por frasco. Adicione 20 mililitros de mídia de coleta EV em cada frasco.
E incuba-los a 37 graus Celsius em ambiente de 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Colete a mídia e centrífuga por 10 minutos a 300 g e quatro graus Celsius. Em seguida, colete o supernaspe, e centrifugar a mídia por 20 minutos a 2.000 g e quatro graus Celsius.
Colete o supernante novamente, e centrifugar a mídia por 30 minutos a 15,500 g e quatro graus Celsius. Pegue o supernatante pela última vez. Em seguida, transfira a mídia para tubos ultracentrifuus.
Um rotor de ângulo fixo 60Ti é usado aqui, e a pelota será ancorada na lateral do tubo. Marque o lado da tampa onde a pelota é esperada, e desenhe um círculo na lateral do tubo onde a pelota é esperada. E pelotar as exRNAs por 90 minutos a 100.000 g e 4 graus Celsius.
Após a centrifugação final, remova o supernatante. Use pequenos pedaços de papel absorvente para secar o interior do tubo sem tocar na parte inferior do tubo. E então inverter o tubo em um papel absorvente.
Para resuspensar a pelota, adicione 200 microliters de PBS em cada tubo, e vórtice do tubo por 30 segundos. Pipeta para cima e para baixo 20 vezes. Em seguida, avalie as vesículas extracelulares e outras biomoléculas com análise de rastreamento de nanopartículas.
E armazene a pelota a menos de 80 graus Celsius até mais experimentos. Após descongelar as amostras, use um kit de isolamento de RNA para extrair RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Elute o RNA da coluna fornecida no kit de isolamento RNA em 100 microliters de água sem RNAse.
Para concentrar o RNA através da precipitação do etanol, adicione um microlitro de glicogênio, 10 microliters de dois molares pH-5,5 acetato de sódio e 250 microliters de 99% de etanol pré-refrigerado em 100 microliters do RNA purificado. Em seguida, incubar as amostras a menos de 20 graus Celsius durante a noite para precipitar o RNA. Para pellet o RNA, centrífuga por 20 minutos a 16.000 g e quatro graus Celsius.
Em seguida, remova o supernasce e lave a pelota de RNA com um mililitro de 75% de etanol. Centrifugar novamente por cinco minutos a 16.000 g e quatro graus Celsius para pellet o RNA. Retire o etanol e deixe a tampa do tubo RNA aberta por cinco a 10 minutos para secar o RNA ao ar.
Resuspenja a pelota de RNA em sete microlitadores de água sem RNAse, e use uma máquina de eletroforese capilar baseada em chip para detectar a qualidade e concentração do RNA. Para começar a construção da biblioteca, pipeta cinco microliters do RNA em um tubo PCR pré-refrigerado de 0,2 mililitro. Em seguida, diluir 3'adaptadores em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10.
Adicione 0,5 microliters do adaptador diluído no tubo RNA e pipeta a mistura para cima e para baixo oito vezes. Centrífuga brevemente para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo. Incubar a mistura do adaptador RNA a 70 graus Celsius por dois minutos em um ciclor térmico pré-aquecido.
E então coloque a amostra de volta no bloco refrigerado. Em seguida, adicione um microliter do buffer de ligadura, 0,5 microliters do inibidor RNAse e 0,5 microliters da liga ligase T4 RNA na mistura do adaptador RNA. Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e centrífuga brevemente.
Em seguida, incubar o tubo a 28 graus Celsius durante uma hora no ciclo térmico pré-aquecido. Em seguida, adicione 0,5 microliters da solução stop no tubo de amostra, com o tubo permanecendo no ciclofatómpro térmico. Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e continuar a incubar a 28 graus Celsius por 15 minutos.
Diluir adaptadores de 5''em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10. Adicione 0,5 microliters do adaptador diluído em um tubo PCR separado de 0,2 mililitro. Aqueça o adaptador de 5'5 a 70 graus Celsius por dois minutos.
E, em seguida, coloque a amostra no bloco refrigerado. Adicione 0,5 microliters de 10 nanomol ATP e 0,5 microliters da liga ligase T4 RNA ao tubo adaptador de 5'. Pipeta para cima e para baixo oito vezes.
E centrífuga brevemente para coletar todos os líquidos no fundo. Em seguida, adicione 1,5 microliters da mistura de adaptador de 5''na amostra de RNA. Pipeta oito vezes muito suavemente, e incubar a amostra a 28 graus Celsius por uma hora.
Para obter cDNA, diluir o primer de transcriptase reversa em água livre de RNAse em uma proporção de volume de um a 10. Adicione 0,5 microliters do primer diluído na amostra de RNA, pipeta oito vezes muito suavemente e centrífuga brevemente. Em seguida, incubar o RNA e a mistura de primer a 70 graus Celsius por dois minutos no ciclo térmico pré-aquecido.
E, em seguida, colocar a amostra em um bloco refrigerado. Em seguida, adicione um microlitr de 5X First Strand Buffer, 0,5 microliters de 12,5 mililitros DNTP mistura, 0,5 microliters de 100-millimolar DTT, 0,5 microliters do inibidor RNAse e 0,5 microliters de transcriptase reversa no tubo de amostra. Pipeta oito vezes muito gentilmente.
E centrífuga brevemente. Incubar a amostra a 50 graus Celsius durante uma hora no ciclo térmico pré-aquecido. Em seguida, adicione 4,25 microliters de água ultrauso, 12,5 microliters do mix PCR, um microliter do primer de índice e um microliter do primer universal na amostra cDNA.
Pipeta para cima e para baixo oito vezes, e centrífuga brevemente. Finalmente, coloque a amostra em um cicloviário térmico e configure o ciclo cicrário de acordo com o manuscrito. Para purificar a biblioteca RNA, use um fracionador automatizado de tamanho de DNA para elutar as bandas entre 140 e 160 pares de base.
Execute a biblioteca extraída em um kit de purificação PCR baseado em coluna, e elute a biblioteca em 10 microliters de água sem RNAse. Para verificar o tamanho da biblioteca, carregue um microliter da biblioteca purificada em um chip de DNA e siga o protocolo do fabricante. Para quantificar a concentração da biblioteca, primeiro dilui um microliter da biblioteca purificada em 10 mililitros pH-8,0 Tris-Hcl com 0,05% polisorbate 20 em uma proporção de volume de 1 a 1.000.
Em seguida, execute o QPCR usando os padrões de DNA do kit de quantificação da biblioteca comercial. Finalmente, acumule quantidades iguais das bibliotecas de acordo com os requisitos da máquina de sequenciamento e sequência em um sistema de sequenciamento de alto rendimento. O eletroferograma de RNAs extracelulares incluiu uma ampla gama de RNA.
Em contraste, o RNA celular apresentou picos muito distintos, correspondendo ao 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA e 28SrRNA. A qualidade resultante de ambas as bibliotecas foi alta e comparável. A distribuição de comprimento de ambas as bibliotecas mostrou um único pico em 22 nucleotídeos, com correlações com microRNAs.
Em contraste, as bibliotecas de RNAs extracelulares eram mais heterogêneas, e continham mais dois picos que se correlacionam com tRNAs, metades e fragmentos, ou piRNAs. 65% das leituras do RNA celular foram mapeadas para microRNAs humanas, e cada uma das outras pequenas RNAs foi responsável por uma pequena parte das leituras mapeadas. Em contraste, apenas 8% das RNAs extracelulares corresponderam às microRNAs humanas.
O pequeno RNA mais abundante para o qual as leituras mapeadas foram tRNAs, e as leituras incomparáveis mais tarde corresponderam a sequências bacterianas. Uma comparação com o genoma bovino sugeriu que a FBS não era uma fonte de contaminação. Assim, as RNAs extracelulares exibem um perfil atípico em comparação com o RNA celular normal.
A preparação da biblioteca é uma parte crucial deste protocolo. A mistura deve ser feita muito suavemente para evitar que bolhas se formem. Este método também pode ser usado para investigar o perfil de exRNAs de outros tipos de células, o que ajuda a estudar a função de exRNAs.
