Dies ist das erste Papier, das technische Probleme bei der Sequenzierung kleiner RNAs aus extrazellulären Vesikeln aus Zellen behandelt. NGS-Proben erfordern eine strenge Vorbereitung und Qualitätskontrolle. Aufgrund der Natur von Elektrofahrzeugen weicht der QC-Prozess von EV-Proben von der Norm ab.
Der Vorteil dieses Protokolls sind die QC-Schritte darin für Erstanwender. Demonstriert wird das Verfahren von Junyi Su, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor. Zunächst sollten menschliche mesenchymale Stammzellen in fünf T175-Flaschen mit 2 000 Zellen pro Quadratzentimeter in frischen MSC-Medien plattiert werden.
Dann wachsen die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung und ersetzen die Medien alle zwei bis drei Tage, bis fünf Kolben von 90% konfluenten Zellen erhalten werden. Als nächstes waschen Sie die Zellen dreimal mit 20 Milliliter PBS pro Kolben. Fügen Sie 20 Milliliter EV-Sammlungsmedien in jeden Kolben ein.
Und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für 48 Stunden. Sammeln Sie die Medien und zentrifugieren Sie es für 10 Minuten bei 300 g und vier Grad Celsius. Dann sammeln Sie den Überstand, und zentrifugieren Sie die Medien für 20 Minuten bei 2 000 g und vier Grad Celsius.
Sammeln Sie den Überstand wieder, und zentrifugieren Sie die Medien für 30 Minuten bei 15, 500 g und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand zum letzten Mal. Übertragen Sie als Nächstes die Medien in Ultrazentrifugenrohre.
Hier kommt ein 60Ti Festwinkelrotor zum Einsatz, und das Pellet wird an der Seite des Rohres verankert. Markieren Sie die Seite des Deckels, an der das Pellet erwartet wird, und ziehen Sie einen Kreis an der Seite des Rohres, wo das Pellet erwartet wird. Und pellet die exRNAs für 90 Minuten bei 100, 000 g und vier Grad Celsius.
Entfernen Sie nach der letzten Zentrifugation den Überstand. Verwenden Sie kleine Stücke von saugfähigem Papier, um die Innenseite des Rohres zu trocknen, ohne den Boden des Rohres zu berühren. Und dann das Rohr auf einem saugfähigen Papier umkehren.
Um das Pellet wieder aufzuhängen, fügen Sie 200 Mikroliter PBS in jedes Rohr ein und wirbeln Sie das Rohr für 30 Sekunden. Pipette 20 Mal rauf und runter. Bewerten Sie dann die extrazellulären Vesikel und andere Biomoleküle mit Nanopartikel-Tracking-Analyse.
Und das Pellet bei minus 80 Grad Celsius bis zu weiteren Experimenten lagern. Nach dem Auftauen der Proben verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um RNA gemäß dem Herstellerprotokoll zu extrahieren. Elute die RNA aus der Säule im RNA-Isolationskit in 100 Mikroliter RNAse-freiem Wasser.
Um die RNA durch Ethanolfällung zu konzentrieren, fügen Sie einen Mikroliter Glykogen, 10 Mikroliter zweimolares pH-Natriumacetat und 250 Mikroliter vorgekühltes 99%Ethanol in 100 Mikroliter der gereinigten RNA ein. Dann inkubieren Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius über Nacht, um die RNA auszufällen. Um die RNA zu pellet, Zentrifuge für 20 Minuten bei 16, 000 g und vier Grad Celsius.
Als nächstes entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter 75% Ethanol. Zentrifugieren Sie wieder für fünf Minuten bei 16.000 g und vier Grad Celsius, um die RNA zu pellet. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie den Deckel der RNA-Röhre fünf bis zehn Minuten offen, um das RNA-Pellet lufttrocken zu machen.
Setzen Sie das RNA-Pellet in sieben Mikroliter RNAse-freiem Wasser aus und verwenden Sie eine chipbasierte Kapillarelektrophoresemaschine, um die RNA-Qualität und -Konzentration zu erkennen. Um mit dem Bibliotheksbau zu beginnen, pipette fünf Mikroliter der RNA in eine vorgekühlte 0,2-Milliliter-PCR-Röhre. Als nächstes 3'Adapter in RNAse-freiem Wasser mit einem Volumenverhältnis von 1 zu 10 verdünnen.
0,5 Mikroliter des verdünnten Adapters in die RNA-Röhre geben und das Gemisch achtmal rauf und runter pipette. Zentrifuge kurz, um die gesamte Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Inkubieren Sie das RNA-Adaptergemisch bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten in einem vorgeheizten Thermischen Cycler.
Und dann legen Sie die Probe wieder auf den gekühlten Block. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter des Ligationspuffers, 0,5 Mikroliter RNAse-Inhibitor und 0,5 Mikroliter der T4-RNA-Ligase in das RNA-Adaptergemisch ein. Achtmal auf und ab zentrieren und kurz zentrieren.
Dann inkubieren Sie die Röhre bei 28 Grad Celsius für eine Stunde im vorgeheizten Thermischen Cycler. Als nächstes fügen Sie 0,5 Mikroliter der Stop-Lösung in das Probenrohr, wobei das Rohr im thermischen Cycler bleibt. Pipette achtmal rauf und runter und 15 Minuten bei 28 Grad Celsius weiter bebrütet.
Verdünnen Sie 5'Adapter in RNAse-freiem Wasser mit einem Volumenverhältnis von 1 zu 10. 0,5 Mikroliter des verdünnten Adapters in ein separates 0,2-Milliliter-PCR-Rohr geben. Den 5'Adapter bei 70 Grad Celsius zwei Minuten erhitzen.
Und dann legen Sie die Probe auf den gekühlten Block. Fügen Sie 0,5 Mikroliter 10-Nanomol ATP und 0,5 Mikroliter der T4-RNA-Ligase in das 5'Adapter-Rohr. Pipette achtmal rauf und runter.
Und Zentrifugieren Sie kurz, um alle Flüssigkeiten in den Boden zu sammeln. Als nächstes fügen Sie 1,5 Mikroliter der 5'Adapter-Mischung in die RNA-Probe ein. Pipette achtmal sehr sanft, und inkubieren Sie die Probe bei 28 Grad Celsius für eine Stunde.
Um cDNA zu erhalten, verdünnen Sie den Reverse-Transkriptase-Primer in RNAse-freiem Wasser mit einem Volumenverhältnis von eins zu 10. 0,5 Mikroliter des verdünnten Primers in die RNA-Probe geben, achtmal sehr sanft Pipette und kurz Zentrifugieren. Dann inkubieren Sie die RNA und die Primermischung bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten im vorgeheizten Thermischen Cycler.
Und dann legen Sie die Probe auf einem gekühlten Block. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 5X First Strand Buffer, 0,5 Mikroliter 12,5-Millimolar DNTP-Mischung, 0,5 Mikroliter 100-Millimolar DTT, 0,5 Mikroliter RNAse-Inhibitor und 0,5 Mikroliter Reverse-Transkriptase in das Probenröhrchen. Pipette achtmal sehr sanft.
Und Zentrifuge kurz. Inkubieren Sie die Probe bei 50 Grad Celsius für eine Stunde im vorgeheizten Thermocycler. Als nächstes fügen Sie 4,25 Mikroliter Reinstwasser, 12,5 Mikroliter des PCR-Mix, einen Mikroliter der Indexgrundierung und einen Mikroliter des Universalprimers in die cDNA-Probe ein.
Achtmal auf und ab zentrieren und kurz zentrieren. Schließlich legen Sie die Probe in einen thermischen Cycler, und richten Sie den Cycler entsprechend dem Manuskript ein. Um die RNA-Bibliothek zu reinigen, verwenden Sie einen automatisierten DNA-Größenfraktionator, um die Bänder zwischen 140 und 160 Basenpaaren zu eluten.
Führen Sie die extrahierte Bibliothek auf einem säulenbasierten PCR-Reinigungskit aus, und löschen Sie die Bibliothek in 10 Mikroliter RNAse-freiem Wasser. Um die Größe der Bibliothek zu überprüfen, laden Sie einen Mikroliter der gereinigten Bibliothek auf einen DNA-Chip und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. Um die Bibliothekskonzentration zu quantifizieren, verdünnen Sie zunächst einen Mikroliter der gereinigten Bibliothek in 10-Millimolar pH-8.0 Tris-Hcl mit 0,05%Polysorbat 20 bei einem 1-zu-1,000-Volumenverhältnis.
Führen Sie dann QPCR mit den DNA-Standards des quantifizierungskits für kommerzielle Bibliotheken aus. Schließlich wird der Pool gleiche Mengen der Bibliotheken entsprechend den Anforderungen des Sequenzierungscomputers und die Reihenfolge auf einem Sequenzierungssystem mit hohem Durchsatz zusammengefasst. Das Elektropherogramm extrazellulärer RNAs umfasste ein breites Spektrum an RNA.
Im Gegensatz dazu zeigte die zelluläre RNA sehr unterschiedliche Spitzen, die 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA und 28SrRNA entsprachen. Die daraus resultierende Qualität beider Bibliotheken war hoch und vergleichbar. Die Längenverteilung beider Bibliotheken zeigte einen einzigen Peak bei 22 Nukleotiden, mit Korrelationen mit microRNAs.
Im Gegensatz dazu waren die Bibliotheken von extrazellulären RNAs heterogener und enthielten zwei weitere Spitzen, die mit tRNAs, Hälften und Fragmenten oder piRNAs korrelieren. 65 % der Lesevorgänge aus zellulärer RNA wurden menschlichen microRNAs zugeordnet, und jeder der anderen kleinen RNAs machte einen kleinen Teil der zugeordneten Lesevorgänge aus. Im Gegensatz dazu stimmten nur 8 % der extrazellulären RNAs mit menschlichen microRNAs überein.
Die am häufigsten vorkommende kleine RNA, der die Lesevorgänge zugeordnet wurden, waren tRNAs, und die unübertroffenen Lesevorgänge stimmten später mit bakteriellen Sequenzen überein. Ein Vergleich mit dem Rindergenom ergab, dass FBS keine Kontaminationsquelle war. Daher weisen extrazelluläre RNAs ein atypisches Profil im Vergleich zu normaler zellulärer RNA auf.
Die Bibliotheksvorbereitung ist ein wichtiger Bestandteil dieses Protokolls. Das Mischen muss sehr schonend erfolgen, um zu vermeiden, dass sich Blasen bilden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um das Profil von exRNAs aus anderen Arten von Zellen zu untersuchen, was hilft, die Funktion von exRNAs zu untersuchen.
