Bu hücrelerden hücre dışı veziküller türetilen küçük RNA'lar sıralama teknik sorunları gideren ilk kağıttır. NGS örnekleri sıkı hazırlık ve kalite kontrol gerektirir. EV'lerin doğası gereği, EV örneklerinin QC işlemi normdan sapır.
Bu protokolün avantajı ilk kez kullanıcılar için qc adımları burada. Prosedürü gösteren Junyi Su, benim laboratuvarımdan bir araştırma asistanı olacaktır. Başlamak için, beş T175 şişelerinde taze MSC ortamlarında 2, 000 hücre kare başına insan mezenkimal kök hücreleri plaka.
Daha sonra hücreleri %5 karbondioksit ortamında 37 derecede büyütün ve %90 konfluent hücrelerden oluşan beş şişe elde edilene kadar her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin. Daha sonra, şişe başına 20 mililitre PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Her şişeye 20 mililitre EV toplama ortamı ekleyin.
Ve onları 48 saat boyunca %5 karbondioksit ortamında 37 derecede kuluçkaya yatırın. 300 g ve dört santigrat derece 10 dakika medya toplamak ve santrifüj. Sonra supernatant toplamak ve 20 dakika boyunca medya santrifüj 2, 000 g ve dört derece santigrat.
Supernatant tekrar toplamak ve 15, 500 g ve dört derece santigrat 30 dakika boyunca medya santrifüj. Son kez supernatant toplamak. Sonra, ultracentrifuge tüpler için medya aktarın.
Burada 60Ti sabit açılı rotor kullanılır ve pelet tüpün yan tarafına sabitlenir. Kapağın peletin beklendiği tarafı işaretleyin ve peletin beklendiği tüpün yan tarafına bir daire çizin. ExRNA'ları 100, 000 g ve 4 santigrat derecede 90 dakika boyunca peletleyin.
Son santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Tüpün dibine dokunmadan tüpün içini kurutmak için küçük emici kağıt parçaları kullanın. Sonra da tüpü emici bir kağıda ters çevir.
Peleti yeniden askıya almak için, her tüpe 200 mikrolitre PBS ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca girdaplayın. Pipet 20 kez yukarı ve aşağı. Daha sonra nanopartikül izleme analizi ile ekstrasellüler vezikülleri ve diğer biyomolekülleri değerlendirin.
Ve peleti daha fazla deneye kadar eksi 80 derecede saklayın. Numuneleri erittikten sonra, üreticinin protokolüne göre RNA ayıklamak için bir RNA izolasyon kiti kullanın. RNA izolasyon kitinde 100 mikrolitre RNae içermeyen su da sağlanan kolondan RNA'yı eleyin.
RNA'yı etanol yağışı ile yoğunleştirmek için, saflaştırılmış RNA'nın 100 mikrolitresine bir mikrolitre glikojen, 10 mikrolitre iki molar pH-5,5 sodyum asetat ve 250 mikrolitre önceden soğutulmuş %99 etanol ekleyin. Sonra rna çökeltmek için eksi-20 santigrat derece bir gecede örnekleri kuluçka. RNA'yı 16, 000 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin.
Daha sonra, supernatant çıkarın ve% 75 etanol bir mililitre ile RNA pelet yıkayın. RNA'yı peletlemek için 16, 000 g ve 4 santigrat derecede beş dakika daha santrifüj edin. Etanol çıkarın ve RNA pelet hava kuruması için beş ila 10 dakika boyunca RNA tüp kapağı açık bırakın.
RNA peletini yedi mikrolitre RNAiçermeyen suyla yeniden askıya alın ve RNA kalitesini ve konsantrasyonu tespit etmek için çip tabanlı kapiller elektroforez makinesi kullanın. Kütüphane inşaatına başlamak için, pipet, rna beş mikrolitre önceden soğutulmuş 0.2 mililitre PCR tüp içine. Daha sonra, RNAse içermeyen suda 3'adaptörleri bir-10 hacim oranında seyreltin.
RNA tüpüne seyreltilmiş adaptörün 0,5 mikrolitresini ekleyin ve karışımı sekiz kez yukarı ve aşağı pipetle. Tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için kısa bir süre santrifüj edin. RNA adaptör karışımını önceden ısıtılmış bir termal döngüde iki dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Sonra da numuneyi soğutulmuş bloğun üzerine geri yerleştirin. Daha sonra, rna adaptör karışımı içine ligasyon tampon bir mikrolitre, RNa inhibitörü 0.5 mikrolitre ve T4 RNA ligase 0.5 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve santrifüj kısaca.
Daha sonra tüpü önceden ısıtılmış termal döngüde bir saat boyunca 28 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, tüp termal döngüiçinde kalan, örnek tüp içine stop çözeltisi 0,5 mikrolitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve 15 dakika boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya devam.
RNAse içermeyen suda 5'adaptörleri 1-10 hacim oranında seyreltin. Ayrı bir 0.2 mililitre PCR tüp içine seyreltilmiş adaptör 0,5 mikrolitre ekleyin. Isı 5'adapter 70 santigrat derece iki dakika boyunca santigrat.
Sonra da numuneyi soğutulmuş bloğun üzerine yerleştirin. 5'adaptör tüpüne 0,5 mikrolitre 10 nanomol ATP ve 0,5 mikrolitre T4 RNA ligaz ekleyin. Pipet sekiz kez yukarı ve aşağı.
Ve kısaca dibe tüm sıvıları toplamak için santrifüj. Daha sonra, RNA örneğine 5'adaptör karışımının 1,5 mikrolitresini ekleyin. Pipet sekiz kat çok nazikçe, ve bir saat boyunca 28 santigrat derece de örnek kuluçka.
CDNA elde etmek için, RNAse içermeyen sudaki ters transkriptaz astarını 1-10 hacim oranında seyreltin. RNA örneğine seyreltilmiş astarın 0,5 mikrolitresini, pipetini sekiz kat daha nazik çehre ekleyin ve kısaca santrifüj edin. Daha sonra RNA ve astar karışımını önceden ısıtılmış termal döngüde iki dakika boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Sonra da numuneyi soğutulmuş bir bloğun üzerine yerleştirin. Daha sonra, örnek tüpüne 5X First Strand Tampon'un bir mikrolitresini, 12,5 milimolar DNTP karışımının 0,5 mikrolitresini, 100 milimolar DTT'nin 0,5 mikrolitresini, 0,5 mikrolitre RNaAse inhibitörü ve 0,5 mikrolitre ters transkriptaz ekleyin. Pipet sekiz kez çok nazikçe.
Ve kısaca santrifüj. Numuneyi önceden ısıtılmış termal döngüde bir saat boyunca 50 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, cDNA örneğine 4,25 mikrolitre ultrasaf su, 12,5 pcr karışımı, indeks astarının bir mikrolitresi ve evrensel astarın bir mikrolitresini ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı sekiz kez, ve santrifüj kısaca. Son olarak, örneği bir termal döngüye yerleştirin ve çevrimciyi el yazmasına göre ayarlayın. RNA kitaplığını arındırmak için, 140 ile 160 baz çifti arasındaki bantları ayırmak için otomatik dna boyutu fraksiyonu kullanın.
Çıkarılan kitaplığı sütun tabanlı PCR arıtma kitiüzerinde çalıştırın ve kütüphaneyi 10 mikrolitre RNaAse içermeyen suyla aşındırın. Kitaplığın boyutunu kontrol etmek için, saflaştırılmış kütüphanenin bir mikrolitresini BIR DNA çipine yükleyin ve üreticinin protokolünü izleyin. Kütüphane konsantrasyonunu ölçmek için, arıtılmış kütüphanenin bir mikrolitresini 10 milimolar pH-8.0 Tris-Hcl'de %0,05 polisorbat 20 ile bire bir hacim oranında seyreltin.
Daha sonra ticari kütüphane niceleme kitinin DNA standartlarını kullanarak QPCR çalıştırın. Son olarak, sıralama makinesinin gereksinimlerine göre kitaplıkların eşit miktarda havuz ve yüksek iş yapma lı sıralama sistemi üzerinde sıralanır. Hücre dışı RNA'ların elektroferogramı geniş bir RNA aralığını içeriyordu.
Buna karşılık, hücresel RNA 5StRNA, 5SrRNA, 18SrRNA ve 28SrRNA'ya karşılık gelen çok belirgin zirveler gösterdi. Her iki kütüphanenin ortaya çıkan kalitesi yüksek ve karşılaştırılabilir. Her iki kütüphanenin uzunluk dağılımı 22 nükleotitte tek bir tepe gösterdi ve mikroRNA'larla ilişkilidir.
Buna karşılık, hücre dışı RNA'lardan gelen kütüphaneler daha heterojendi ve tRNA'lar, yarılar ve parçalar veya piRNA'larla ilişkili iki zirve daha içeriyordu. Hücresel RNA'dan okunan okumaların %65'i insan mikroRNA'larına eşlendi ve diğer küçük RNA'ların her biri haritalanmış okumaların küçük bir kısmını oluşturuyordu. Buna karşılık, hücre dışı RNA'ların sadece %8'i insan mikroRNA'ları ile eşleşti.
En bol küçük RNA hangi okur eşlenen tRNA vardı, ve eşsiz okur daha sonra bakteri dizileri ile eşleşti. Büyükbaş genomu ile yapılan bir karşılaştırma, FBS'nin bir kontaminasyon kaynağı olmadığını ileri sürmüştür. Bu nedenle, hücre dışı RNA'lar normal hücresel RNA ile karşılaştırıldığında atipik bir profil sergilerler.
Kütüphane hazırlama bu protokolün önemli bir parçasıdır. Karıştırma çok nazikçe kabarcıklar oluşmasını önlemek için yapılmalıdır. Bu yöntem, exRNA'ların işlevini incelemeye yardımcı olan diğer hücre türlerinden exRNA'ların profilini araştırmak için de kullanılabilir.
