Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave. En el campo de la humanología. Esa respuesta en la función de los macrófagos bajo el fin fisiológico de las condiciones patológicas.
La principal ventaja de esta técnica es que la polietilenimina recubierta puede en vitro eficientemente sin comprometer la célula. Bajo dosis óptimas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de muchos trastornos inflamatorios crónicos y cánceres.
Donde los macrófagos juegan un papel esencial en la patogénesis. Demostrar el procedimiento será Na Jia. Un estudiante graduado de mi laboratorio.
Y Kaixuan Wang un estudiante graduado del laboratorio del Dr.Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas modificadas por ácido allí, o las primeras de SPION añadir 28 gramos de cloruro de pharas hexahidrato. Y 20 gramos de heptahidrato autoate pharas a un vaso de precipitados que contiene 80 mililitros de agua desionizada.
Y utilice un conducto de vidrio para introducir nitrógeno en la solución. Revolviendo hasta que la materia sólida se haya disuelto. Calienta la mezcla de reacción a 72 grados Celsius con agitación a 800 rotaciones por minuto.
Y añadir 40 mililitros de 28% de agua de amoníaco al vaso de precipitados. Después de cinco minutos añadir nueve mililitros de ácido allílico gota sabia. Y mantener la mezcla a 72 grados Centígrados durante tres horas con agitación continua.
Al final de la incubación enfriar la solución resultante a temperatura ambiente. Y precipitar la mezcla a través de la separación magnética de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, lave el SPION que contenga precipitado tres veces con alcohol etílico absoluto.
Y aspers el precipitado en 100 mililitros de n-hexano. Para preparar el ácido acrílico dimercapto modificado SPION añadir 800 miligramos del ácido allí modificado SPION. Dispersos en 200 mililitros de n-hexano y 400 miligramos de dimercapto ácido acrílico dispersos en 200 mililitros de acetona en un matraz de tres cuellos en un baño de agua a 60 grados centígrados.
A continuación, añadir 200 microlitros de trietilamina gota sabia al matraz con agitación a 1000 rotaciones por minuto y reflujo. Un precipitado negro se puede obtener por separación magnética después de cinco horas. A continuación, utilice hidróxido de tetrametilammonio para ajustar el pH de la solución para dispersos homogéneos de los SPION hidrófilos en agua desionizada.
La polietilenimina degenerada recubierta de SPION añade el ácido acrílico dimercapto modificado la solución coloidal de SPION caer sabiamente en una solución de polietilenimina de 10 kilodalton. En un matraz de tres cuellos de 500 mililitros bajo agitación mecánica a 1000 rotaciones por minuto durante dos horas. Al final de la incubación añadir la solución resultante a un tubo de ultrafiltración con un peso molecular cortado de 100 kilodaltones y un contenido de 15 mililitros.
Centra la muestra hasta que la solución restante alcance un volumen de un mililitro. Añadir agua desionizada a la solución para devolver el volumen a 15 mililitros. Y centra y rehidrata la solución diez veces más como se acaba de demostrar.
A continuación, filtre la solución a través de un filtro de 22 micras para almacenarla a cuatro grados centígrados. Para preparar primero las nanopartículas de siRNA agregue tres microlitros de 20 soluciones de siRNA micromolar recién preparadas a cinco tubos de microcentroafusión libres de ARN etiquetado. Y agregue 0, 8, 1.6, 3.2 y 6.4 microgramos de polietilenimina SPION a tubos etiquetados con cero, uno, dos, cuatro y ocho respectivamente.
Después de mezclar con pipeteo suave, incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de siRNA de polietileno SPION. Y prepara un gel de agarosa del tres por ciento con agarosa de pureza. Al final de la incubación añadir un microlitro de 6X Tampón de carga de ADN por cinco microlitros de muestra a cada tubo y mezclar cuidadosamente.
A continuación, cargue todas las muestras en el gel. Y ejecuta electroforesis a cinco voltios por centímetro. Hasta que el colorante azul bromofenol migra dos tercios de la longitud del gel.
Un día antes de la transfección lavar un microfago de ratón como RAW264.7 cultivo celular con PBS. Y tratar las células con un mililitro de 25% de trippsina durante cinco a diez minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Cuando la mayoría de las células se han desprendido.
Inactivar la trippsina con cinco mililitros de DMEN completo. A continuación, pipte la solución varias veces para dispersar cualquier clúster de celdas. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros de conackel para centrifugación.
Luego re suspenda las células en cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir las células a una 4,5 veces diez a las cuartas células por mililitro de concentración completa de DMEN. Y añadir dos mililitros de medio a cada pozo de un plato de seis pozos para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular.
Al día siguiente preparar la proporción adecuada de nanopartículas de siRNA de polietilenimina SPION en un tubo de microcentrífuga de flujo de ARN de 1,5 mililitros con mezcla suave como se acaba de demostrar. Y añadir el volumen adecuado de polietilenimina SPION siRNA complejo de nanopartículas a cada pozo que ha sido reemplazado por un mililitro de medio fresco. Preparar complejos de polietilenimina SPION si.
en este caso se pueden utilizar muchos más meses de polietilenimina SPION minimizando así su toxicidad potencial. A continuación, gire la placa cuidadosamente para lograr una distribución uniforme de las nanopartículas a través de los fondos de los pozos. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular hasta que se actualice la actualización celular posterior o se anule el análisis de deficiencia de desencamiento genético.
Los SPION de polietilenimina con un potencial zeta de 30,5 y 37 milivoltios no presentan una toxicidad aparente del cito a concentraciones de hasta 30 microgramos de hierro por mililitro. Que es aproximadamente dos veces contratada que la concentración normalmente utilizada para la transfección celular. El potencial zeta de polietilenimina SPION de 48 milivoltios sin embargo son tóxicos.
Incluso a la dosis más baja examinada. Según lo analizado por la citometría de flujo, más del 90% de las células pueden ser transfectadas con complejos de siRNA SPION de polietileno con etiqueta fluorescente a 15 microgramos de hierro por mililitro. La evaluación de los efectos de las concentraciones de siRNA de polietilenimina SPION en la internalización celular mediante el aplastamiento de la tinción azul revela una tinción mínimamente detectable a 7,5 microgramos de hierro por mililitro.
Pero manchas claramente visibles a 15 microgramos de hierro por mililitro que no aumentan a mayores concentraciones de hierro probablemente debido a la saturación de absorción de siRNA de polietilenimina SPION. Los macrófagos peritoneales trans infectados con el SIRNA específico de polietilenimina SPION presentan una disminución significativa en los niveles de ARNm de targe en comparación con el siRNA no específico. Sugiriendo que el siRNA puede escapar de las vesículas endocíticas en el citoplasma para llegar a la maquinaria de interferencia de ARN.
Después de la inyección intravenosa de una dosis única de complejos de nanopartículas DE polietileno SPION siRNA, el análisis flocentimétrico de células CD11b positivas y CD3 positivas revela una absorción más eficiente de las nanopartículas por CD11b expresando macrófagos que por células positivas CD3 en cualquier momento en todos los órganos examinados. Al intentar este procedimiento es importante recordar preparar la polietilenimina SPION con un potencial de datos promedio no superior a 37 milivoltios y preparar los complejos de siRNA DE SIRNA de polietilenimina SPION en las proporciones bajas de hierro a siRNA. Esta técnica compara la necesidad de que los investigadores exploren el potencial terapéutico de apuntar a los macrófagos en motores animales de enfermedades humanas como el cáncer.
