이 측정값은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인문학 분야에서. 병리학적 조건에 생리적 끝에 있는 대식세포 의 기능에 있는 그 대답.
이 기술의 주요 장점은 코팅 된 폴리에틸렌네이민이 세포를 손상시키지 않으면서 효율적으로 생체 외에서 할 수 있다는 것입니다. 최적의 복용량에서. 이 기술의 의미는 많은 만성 염증 성 장애및 암의 치료와 진단으로 확장됩니다.
대식세포가 병인에 필수적인 역할을 하는 곳. 절차를 시연하는 것은 나지아가 될 것입니다. 내 실험실에서 대학원생.
그리고 Kaixuan 왕 박사 샤오화 박사의 실험실에서 대학원 생. 아렐산 수정 슈퍼 파라자성 산화나노입자 또는 SPION의 첫 번째 28그램의 파라클로리드 헥사하이드레이트를 준비한다. 그리고 20 그램 의 파라는 탈이온 화 물의 80 밀리리터를 포함하는 비커에 heptahydrate.
그리고 유리 도관을 사용하여 용액에 질소를 도입하십시오. 고체 물질이 용해될 때까지 저어줍니다. 반응 혼합물을 섭씨 72도로 가열하여 분당 800회전에서 저어줍니다.
그리고 비커에 28 %의 암모니아 물 40 밀리리터를 추가합니다. 5분 후 9밀리리터의 아일산 드롭을 현명하게 추가합니다. 그리고 연속 교반과 3 시간 동안 섭씨 72도에서 혼합물을 유지합니다.
인큐베이션의 끝에서 실온에 대한 결과 솔루션을 냉각시. 및 표준 프로토콜에 따라 자기 분리를 통해 혼합물을 침전한다. 그런 다음 침전을 함유한 SPION을 절대 에틸 알코올로 세 번 씻는다.
그리고 n-헥산의 100 밀리리터에 침전을 배분. 디메카토 아크릴산을 준비하려면 변형된 SPION의 800 밀리그램의 아를랄산 변형 SPION의 추가. 200밀리리터의 n-헥산과 400밀리그램의 이압성 아크릴산에 분산되어 200밀리리터의 아세톤에 60°C의 수조에서 3개의 목 플라스크에 분산되어 있습니다.
다음으로 분당 1000회전에서 교반하고 역류를 가하는 플라스크에 트리에틸라민 드롭 200마이크로리터를 넣습니다. 검은 침전은 5시간 후에 자기 분리에 의해 얻어질 수 있다. 그런 다음 테트라메틸람모늄 수산화를 사용하여 용액의 pH를 조절하여 탈이온화된 물에서 수성 성 SPION의 동질 분산용 용액을 조절한다.
퇴화 폴리에틸렌네이민 코팅 SPION's는 디메카토 아크릴산을 첨가하여 SPION의 콜로이드 용액을 10킬로달톤 폴리에틸렌네이민 용액으로 현명하게 떨어뜨립니다. 500 밀리리터에서 2 시간 동안 분당 1000 회전에서 기계적 교반 에서 세 목 플라스크. 인큐베이션의 끝에서 100킬로달톤의 분자량이 차단되고 15 밀리리터의 함량을 가진 울트라 여과 튜브에 결과 용액을 추가합니다.
나머지 용액이 1밀리리터 부피에 도달할 때까지 샘플을 센트라퓨즈합니다. 용액에 탈이온화된 물을 추가하여 볼륨을 15 밀리리터로 되돌려 보세요. 그리고 단지 입증된 바와 같이 10배 더 솔루션을 다시 수분하고 재수화합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 보관할 수 있도록 22미크론 필터를 통해 용액을 필터링합니다. siRNA 나노 입자를 준비하기 위해 먼저 5 개의 라벨이 부착 된 RNA의 무료 마이크로 센트로아프로폰 튜브에 갓 준비 된 20 마이크로 몰라 siRNA 솔루션 3 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 각각 0, 8, 1.6, 3.2 및 6.4 마이크로그램의 폴리에틸렌네이민 SPION을 0, 1, 2, 4 및 8로 표시한 튜브에 추가합니다.
부드러운 파이펫팅과 혼합한 후, 실온에서 30분 동안 시료를 배양하여 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체가 형성되도록 합니다. 그리고 순도 아가로즈와 함께 3% 아가로즈 젤을 준비합니다. 인큐베이션의 끝에 각 튜브에 샘플의 5 마이크로 리터 당 6X DNA 로딩 버퍼의 하나의 마이크로 리터를 추가하고 신중하게 혼합.
그런 다음 모든 샘플을 젤에 로드합니다. 그리고 전기 전도를 센티미터당 5볼트로 실행합니다. 브로모페놀 블루 염료가 겔 길이의 3분의 2를 이동할 때까지.
1일 전에 는 PBS를 사용하여 RAW264.7 세포 배양과 같은 마우스 미세파기를 세척한다. 그리고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5~10분 동안 25%의 트립신1밀리리터로 세포를 치료합니다. 세포의 대다수가 분리되었을 때.
완전한 DMEN의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 그런 다음 모든 셀 클러스터를 분산시키기 위해 용액을 여러 번 배분합니다. 세포 현탁액을 멸균 15 밀리리터 코나켈 튜브로 전달하여 원심분리를 한다.
그런 다음 계산을 위해 신선한 완전한 DMEN의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 완전한 DMEN 농도의 밀리리터 당 4 세포에 4.5 배 10 배 세포를 희석. 그리고 세포 배양 인큐베이터에서 24 시간 배양에 대한 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2 밀리리터를 추가합니다.
다음날 1.5 밀리리터 RNA 스트림 미세 원심분리기 튜브에서 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 나노입자의 적절한 비율을 준비하여 부드럽게 혼합한다. 그리고 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 나노입자 복합체의 적절한 부피를 신선한 배지의 1밀리리터로 대체하였다. 폴리에틸렌네이민 스피온 시 복합체를 준비한다.
이 경우 폴리에틸렌네이민 SPION의 더 많은 달이 사용될 수 있으므로 잠재적인 독성을 최소화할 수 있다. 그런 다음 플레이트를 조심스럽게 소용돌이어 우물 바닥에 걸쳐 나노 입자의 균일 한 분포를 달성합니다. 후속 세포 업데이트 또는 유전자 녹다운 결핍 분석까지 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.
30.5 및 37 밀리볼트의 제타 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION은 밀리리터 당 최대 30 마이크로그램의 철분 농도에서 명백한 사이토 독성을 나타내지 않습니다. 이는 일반적으로 세포 형질에 사용되는 농도보다 약 2 배 고용이다. 폴리에틸렌네이민 스피온의 제타 잠재력 48 밀리볼트는 그러나 독성이 있다.
심지어 가장 낮은 복용량에서 검사. 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이, 세포의 90% 이상이 밀리리터당 15마이크로그램의 철분에서 형광으로 표지된 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 복합체로 전염될 수 있다. 블루 스테인링을 분쇄하여 세포 내화에 대한 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 농도의 효과에 대한 평가는 밀리리터 당 7.5 마이크로그램의 철분에서 최소한의 검출 가능한 염색을 보여줍니다.
그러나 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 섭취량으로 인해 더 높은 농도의 철분농도에서 증가하지 않는 밀리리터당 15 마이크로그램의 철분에서 명확하게 눈에 띄는 반점이 명확하게 드러난다. 폴리에틸렌아이민 SPION의 특정 siRNA항구로 감염된 회리세포는 비특이적 siRNA에 비해 타지 mRNA 수치가 현저한 감소를 나타낸다. siRNA는 RNA 간섭 기계에 도달하기 위하여 세포질로 내세포 소포에서 탈출할 수 있다는 것을 건의합니다.
또한 1회 투여량의 폴리에틸렌에이민 스피온 siRNA 나노입자 복합체의 정맥 주사 후 CD11b 양성 및 CD3 양성 세포의 flocentimetrical 분석을 통해 검사된 모든 기관에서 CD3 양성 세포보다 더 효율적인 세포세포를 발현하는 CD11b에 의한 나노입자의 보다 효율적인 섭취를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 37 밀리볼트보다 높지 않은 평균 데이터 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION의 준비를 기억하고 낮은 철에 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체를 siRNA 비율에 준비하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구원이 암과 같은 인간 질병의 동물 모터에 있는 대식세포를 표적으로 하는 치료 잠재력을 탐구하는 필요를 비교합니다.
